糖脂代谢异常对丙型肝炎病毒感染肝细胞SIRT1-AMPK信号通路的影响

于建武 李明荣 张晓宇 孙丽杰 赵勇华 刘伟

慢性HCV感染早期易发生胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和肝脂肪变性[1]。肝脂肪变性和IR加速脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌(HCC)自然进程并导致糖尿病的发生。合并肝脂肪变性的CHC成为临床上难治性的疾病。直接抗病毒药物尽管能有效的清除HCV，仍不能完全阻止HCC的发生。沉默信息调节因子1(SIRT1)和AMP激活蛋白激酶(AMPK)作为重要的蛋白激酶感知细胞能量代谢状态的改变，对肝脏的能量、糖、脂代谢起重要调节作用。既往研究证实HCV下调SIRT1-AMPK信号通路导致肝细胞能量、糖、脂类代谢紊乱有利于HCV复制[2-4]。本研究利用表达HCV核心蛋白的HepG2细胞，观察糖脂代谢异常对HCV感染肝细胞SIRT1-AMPK信号通路的影响。

资料和方法

一、建立表达HCV-core的HepG2细胞系及鉴定

按文献[5]进行。将HepG2细胞(本科保存)接种于12孔板，2×105/孔，70%～80%细胞融合后，采用脂质体Lipofectinmine2000试剂盒(Invitrogen公司)进行转染，并按说明书操作。采用pcDNA3.1-core重组质粒(美国Invitrogen公司)2 μg和Lipofectamine 8 μL进行转染，分别用无血清的1640培养基(美国Promega公司)稀释，充分作用后将混合物加入每孔细胞中，共孵育4 h后，弃掉转染液，更换含10%胎牛血清的1640培养基，在体积分数为0.05的CO2孵箱里继续培养36 h后，利用400 μg/mL的G418(Gibco公司)进行稳定表达的筛选，3周后选出抗性克隆株继续扩大培养，以转染pcDNA3.1空载体的HepG2细胞作为对照组。

表达HCV核心蛋白的HepG2细胞在终浓度分别为1.0、2.0、4.5 g/L葡萄糖的无血清DMEM培养液(美国Gibco 公司)中孵育24 h。表达HCV核心蛋白的HepG2细胞在终浓度分别为0、300、500 μmol/L油酸(美国Sigma Aldrich 公司)和无血清1.0 g/L葡萄糖DMEM培养液中孵育24 h。检测表达HCV核心蛋白的HepG2细胞SIRT1、AMPK活性和表达。

二、SIRT1酶活性检测

应用SIRT1活性荧光定量检测试剂盒(美国Sigma公司)，按照说明书进行操作。常规收集细胞后，加入细胞裂解液[1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)20 μL、5 mol/L NaCl 20 μL、0.5 mol/L EDTA 2 μL、10%NP-40 50 μL、ddH2O 908 μL]1 mL，充分振荡15 min，4℃14 000×g离心10 min，吸取上清液，Bradford方法蛋白定量。吸取上清5 μL，加入30 μL缓冲液、NAD+5 μL、SIRT1底物10 μL，振荡混匀，置37 ℃水浴30 min；再加入5 μL显影液，混匀后置37℃水浴10 min，于紫外线下测吸光值，最后用蛋白浓度校正。每组设3个复孔。SIRT1酶活性用pmol/(μg·min)表示。结果用与1.0 g/L葡萄糖DMEM培养液组的相对比值表示。

三、AMPK α2酶活性检测

提取细胞总蛋白，150 μg蛋白与AMPK α2抗体免疫沉淀。在30 ℃、pH 7.0、40 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)50 μL(0.1 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS成肽、0.2 mmol/L AMP、80 mmol/L NaCl、0.8 mmol/L二硫苏糖醇、5 mmol/L MgCl2和0.2 mmol/L 2 μCi[γ-32P]标记ATP)中激酶反应20 min。取25 μL终产物，p81滤纸点样，体积分数为0.05三氯醋酸+质量分数为0.01焦磷酸钠洗，液体闪烁计数仪(Beckman，LS6500，美国)检测放射强度。结果用与1.0 g/L葡萄糖DMEM培养液组的相对比值表示。

四、蛋白质印迹检测SIRT1和p-AMPK的表达

收集表达HCV核心蛋白的HepG2细胞，按5×106细胞加0.5 mL蛋白裂解液提取细胞总蛋白，蛋白提取液4 ℃、14 000×g离心10 min，取上清液，采用Bradfold法测定蛋白浓度后分装，-70 ℃保存。使用时加上样缓冲液煮沸，取40 μg总蛋白行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，质量分数为0.05脱脂奶粉室温封闭2 h；分别加SIRT1抗体 (美国Santa Cruz公司) 和磷酸化AMPK(p-AMPK)(Thr172)抗体 (1∶1 000)，4 ℃温育过夜。三乙醇胺缓冲液(TBST)洗膜3次，加HRP标记二抗 (1∶10 000)，室温下温育1 h；DAB显色。凝胶成像系统成像并计算条带灰度值。β-肌动蛋白作为内参照。

五、统计学处理

利用SPSS10.0软件进行统计分析，计量资料采用t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同浓度的糖对SIRT1和AMPK活性及表达的影响

随着葡萄糖浓度不断升高，SIRT1和AMPK活性及表达下降。见表1。

二、不同浓度的油酸对SIRT1和AMPK活性及表达的影响

SIRT1和AMPK活性及表达下降。见表2。

表1 不同浓度的糖对SIRT1和AMPK活性及表达的影响(±s)

注：与1 g/L葡萄糖组比，at=3.919，bt=9.505，ct=5.477，dt=9.505，et=5.686，ft =9.268，gt=5.477，ht=8.317，均P<0.01；SIRT1为沉默信息调节因子1；AMPK为AMP激活蛋白激酶；p-AMPK为磷酸化AMP激活蛋白激酶

表2 不同浓度的油酸对SIRT1和AMPK活性及表达的影响(±s)

注：与不含油酸组比，at=4.382，bt=9.505，ct=4.382，dt=8.317，et=5.477，ft=10.694，gt=4.382，ht=8.317，均P<0.01；SIRT1为沉默信息调节因子1；AMPK为AMP激活蛋白激酶；p-AMPK为磷酸化AMP激活蛋白激酶

讨 论

慢性HCV感染早期常引起糖、脂类代谢紊乱，故CHC属于一种代谢性疾病。在调节肝细胞能量、糖、脂类代谢过程中，SIRT1-AMPK信号通路是重要的中枢组成部分。本研究选择HCV-core基因全长片段为目的基因，利用基因转染技术建立稳定表达HCV-core的HepG2细胞株。利用这个细胞模型，观察高糖、高脂对SIRT1-AMPK信号通路的影响。结果发现随着葡萄糖浓度不断升高，SIRT1和AMPK活性及表达下降。

体内脂肪酸分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。每种脂肪酸对组织细胞的功能影响有所不同，棕榈酸主要影响肝细胞的存活力，而油酸则主要诱导三酰甘油在肝细胞内的蓄积[6]。故本研究观察了对脂类代谢调节作用更大的油酸对SIRT1-AMPK信号通路的影响。发现随着油酸浓度不断升高，SIRT1活性及表达下降，AMPK活性及表达下降。Lim 等[7]发现，在C2C12骨骼肌细胞中油酸可增加SIRT1的磷酸化水平，但对SIRT1的总蛋白水平无显著差异，与本研究结果不一致，可能与肌肉和肝脏不同组织间存在差异有关，也可能与HCV感染引起糖脂代谢紊乱有关。

总之，本研究表明高糖高油酸下调HCV感染肝细胞SIRT1-AMPK信号通路的活性及表达。这些结果为今后通过节食或运动改善糖脂代谢紊乱治疗合并IR和肝脂肪变性的CHC患者提供了理论依据。