SUMO特异性蛋白酶3在HBV复制中的作用机制

李青 赖荣陶 卢捷 李自强 谢青 王晖 郭清

慢性乙型肝炎(CHB)感染可能进展为肝硬化和肝衰竭，是导致肝细胞癌(HCC)的主要原因[1]。监测HBV DNA复制是治疗相关肝病和降低发病率和死亡率的主要临床问题。

SUMO化修饰作用广泛，例如细胞信号传导，细胞周期，转录或致癌[2]。SUMO化修饰是一个动态的过程，被SUMO化修饰的蛋白也可以被SUMO特异性蛋白酶家族(SENP)去SUMO[3]。作为SENP的关键成员，SENP3特异性地解偶联SUMO2或SUMO3，可在细胞应激后迅速增加，例如，氧化应激或高血糖应激[4-5]。上调的SENP3可促进细胞凋亡，增殖和癌症转移。然而，SENP3和SENP3相关分子是否参与HBV DNA复制目前尚不清楚。因此，本研究探索SENP3及相关蛋白在HBV DNA复制中的作用。

资料和方法

一、材料

HBV DNA PCR检测试剂盒(达安)、全自动脱水机(ASP300)、石蜡包埋机(EG1150C)、脱蜡机(Autotainer XL)等均来自于德国Leica公司；实时PCR 试剂(Takara)，7500型 PCR 仪购于(美国)ABI公司；DMEM，FBS，PBS(pH7.2)购自(美国)Gibco公司；SENP3、Akt、p-Akt、β-actin一抗及羊抗兔二抗购自(美国)CST公司；PCDNA3.1、RHSENP3质粒由上海交通大学医学院易静课题组赠送；HBV转基因小鼠购于上海斯莱克动物实验中心；SENP3的SiRNA及对照购自广州锐博生物科技有限公司。

二、方法

(一)细胞培养 HepG2、HepG2.215细胞用含有10% FBS和90%的DMEM高糖培养基培养，培养条件：37℃，体积分数为0.05的CO2和适宜湿度的孵箱。

(二)人外周血单个核细胞(PBMC)的分离及总蛋白提取 PBS稀释患者外周血，Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞， 计数，用含SDS上样缓冲液裂解PBMC，充分震荡，100 ℃水浴5 min，冰浴5 min，反复3次，12 000 r/min离心5 min，提取上清液，-80℃保存备用。

(三)质粒转染 HepG2.2.15细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，RHSENP3质粒组设两个浓度100 ng和500 ng，对照组为PcDNA3.1空载质粒。待细胞生长融合达70%～80%后，用100 μL opti-DMEM分别稀释100 ng RHSENP3+400 ng pcDNA3.1、500 ng RHSENP3、500 ng pcDNA3.1质粒和5 μL Lipo 2 000，颠倒混匀，室温放置15 min，然后逐滴加入HepG2.2.15细胞中，培养48 h。收集细胞提取总蛋白，方法如上，每组实验重复3次。

(四)SENP3 siRNA转染 HepG2.2.15细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，设NC组、Si-RNA组。待细胞生长融合达60%～70%后，NC组、si-RNA组按lipo2 000说明书进行转染，48 h后收集细胞，提取总蛋白，方法如上，每组实验重复3次。

(五)实时PCR 检测 使用SYBR○RPremix Ex TaqTM II(Takara，Dalian，China)和ABI 7500仪器(Applied Biosystems，USA)，对SENP3进行扩增。以gapdh为参考基因，应用2-ΔΔCt方法计算mRNA的相对表达水平。采用达安基因公司的HBV DNA PCR试剂盒检测待测样品的HBV DNA载量。

(六)蛋白质印迹 用细胞裂解液裂解PBMC、小鼠肝组织细胞、HepG2、HepG2.2.15细胞，提取细胞总蛋白。BCA法测得蛋白含量。按每个样本50 μg的蛋白质上样，SDS-PAGE电泳，经转膜，4% BSA封闭，一抗、二抗孵育，洗涤后，ECL试剂盒在化学发光成像系统发光检测。

(七)免疫组织化学染色 小鼠肝组织用40 g/L多聚甲醛，4℃固定过夜，制作石蜡切片，常规切片后，脱蜡；30 mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶，50 g/L BSA 室温封闭20 min，兔抗SENP3抗体4℃孵育过夜；洗涤后，加二抗，37℃孵育2 h。加显色剂20 min，核固红复染，封片后观察。

三、统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，GraphPad Prism 5. 0软件进行绘图。两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 HBV DNA载量与其PBMC中SENP3的含量呈反比

两例患者HBV DNA经干扰素治疗后明显降低，分别从3×106IU/mL及4.6×104IU/mL降至<500 IU/mL。而外周血中SENP3蛋白含量显著升高，其含量分别是未经治疗时的5.6倍和2.1倍，Akt的磷酸化水平降低，含量分别是未经治疗时的23.5%和48.7%，见图1A。与5名健康人相比，7例CHB患者PBMC中SENP3蛋白含量显著降低。经灰度定量分析，健康组PBMC中SENP3的蛋白含量是CHB患者的7.4倍，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1B。

图1 患者PBMC中及HepG2、HepG2.2.15细胞中

二、 HBV转基因小鼠肝脏中SENP3的表达

与对照组小鼠相比，HBV转基因小鼠肝脏中SENP3表达显著降低(图2)；HBV转基因小鼠肝组织中磷酸化的Akt含量显著升高，其灰度值平均是对照组的4.1倍，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

图2 HBV转基因小鼠与对照组小鼠肝组织中SENP3的表达(免疫组织化学染色 低倍放大)

图3 HBV转基因小鼠与对照组小鼠肝组织中Akt、p-Akt的表达

三、SENP3和Akt磷酸化水平在HepG2中的表达

SENP3在HBV DNA全基因重组质粒转染的HepG2受体细胞(HepG2.2.15)中表达量显著低于未转染HBV DNA的HepG2细胞，AKT磷酸化水平显著增高(见图4A)。

四、 SENP3通过抑制HepG2.2.15细胞中AKT的磷酸化，从而抑制HBV DNA的复制

在RHSENP3质粒转染100 ng组和500 ng组中，p-AKT的含量分别是对照组(空载质粒)的32.6%和14.8%(P<0.01)，说明SENP3质粒转染浓度越高，Akt磷酸化水平越低(图4B)；当给HepG2.2.15细胞转染100 ng SENP3质粒，细胞中HBV DNA含量由对照组中的7.983.03×106IU/mL降低至3.45×106IU/mL(P<0.01)，若在HepG2.2.15细胞转染500 ng SENP3质粒，细胞中HBV DNA减少至1.92×106IU/mL(P<0.01)；若使用siRNA干扰HepG2.2.15细胞中SENP3的表达，则Akt磷酸化程度显著升高，平均是对照组细胞中的5.6倍(P<0.01)(图4C)。以上结果提示，SENP3是通过抑制肝细胞中Akt的磷酸化水平来抑制HBV DNA复制。

讨 论

本研究观察到CHB患者PBMC中和HBV转基因小鼠肝脏中的SENP3蛋白含量均显著降低。在体外实验模拟HBV感染的细胞模型HepG2.215中，SENP3含量亦显著降低，SENP3相应的mRNA水平也被证实显著降低。这些数据表明SENP3在HBV感染发展过程中有明确的作用。已经证实，HepG2.2.15细胞中大量被磷酸化的Akt可因SENP3过表达而减弱，相应的HepG2.2.15细胞中HBV DNA的复制被抑制。说明SENP3能通过抑制Akt磷酸化来抑制HBV DNA的复制。然而，HBV患者肝细胞内SENP3含量与HBV DNA载量之间的相关性缺乏可靠的证据。

图4 HepG2、HepG2.2.15细胞中SENP3、Akt及p-AKT的表达

已有研究表明，miR-99家族可通过IGF-1R/PI3K/Akt/mTOR/ULK1信号通路诱导肝细胞自噬，促进HBV复制[6]；此外HBcAg通过激活Akt，ERK和P38信号通路诱导B7-H1上调，从而抑制HBV DNA的清除和减低树突细胞数量，HBX蛋白可通过与PI3K的催化亚基相结合促进85位点的磷酸化，活化的PI3K也间接的促进了下游AKT的活化[7-8]。以上结果表明，AKT信号通路参与了调控HBV DNA复制的过程，SENP3是调控AKT磷酸化的重要因子。

总之，SENP3在CHB患者和体内动物模型以及体外HBV肝细胞模型中下调。此外，SENP3能通过抑制Akt磷酸化而抑制HBV DNA的复制。这些数据提示SENP3被用作治疗HBV的潜在治疗靶点的可能性。