不同分子量松花肽增强小鼠免疫力的功能研究

尹利端，王桐，宋文山，刘楚怡，3，*，仲米存，杜芬，李八方，3

（1.烟台新时代健康产业有限公司，山东烟台264006；2.青岛海洋生物医药研究院，山东青岛266001；3.中国海洋大学，山东青岛266073）

松花粉是指经人工采集得到的干燥松树花粉，作为生命的遗传物质，含有丰富的蛋白质、微量元素、黄酮及必需脂肪酸等营养成分[1]及生物活性物质[2]，具有抗衰老、抗氧化、抗疲劳、促进生长发育、调整机体代谢等多种功效[3]。目前松花粉水提物的制备技术已相对成熟，并形成了国珍松花粉等一系列在售产品。但在松花粉水提物的制备过程中，却产生了大量的松花粉粕残渣，这些残渣中还存在着大量优质的蛋白质资源尚未得到充分利用。一般认为松花粉中蛋白质胜于酪蛋白，且质量高于牛肉、鸡蛋蛋白[4]。简单的丢弃松花粉粕不仅会带来环境的压力，也造成了大量营养物质的浪费。因此，安全高效的从松花粉粕中制备具有生物活性的松花肽，成了亟待解决的问题。目前国内关于从松花粉粕中制备活性松花肽的研究未见报道，利用松花粉粕开发具有生物活性的松花肽，具有重要的理论意义和应用价值。

生物活性肽就是指一类相对分子质量小于6 kDa，介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物[5]，具有增强机体防御功能、调节生命节律、预防疾病和促进康复等多种生物学功能的多肽[6]。具有增强免疫功能的活性肽称作免疫活性肽[7]。近年来，已经发现了一些天然免疫活性肤如胸腺肤等，可诱导淋巴细胞分化、增殖与成熟，增强巨噬细胞的吞噬能力[8]，提高机体对外界病原物质的抵抗能力，提高免疫低下小鼠的免疫活性[9]。部分免疫活性肽已经作为一种免疫因子应用于医学临床抗感染、免疫缺乏症的治疗上，并且起到了良好的治疗效果[10]。

本研究从松花粉粕中制备1 kDa～3 kDa和小于1 kDa两种分子量的松花肽，并按照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）[11]要求，对两种平均分子量松花肽的增强免疫力功能进行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

松花粉粕：山东烟台新时代健康产业有限公司；胰蛋白酶（10 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；无水乙醇（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、三氯乙酸（分析纯）、三氟乙酸（分析纯）、硫化钠（分析纯）、乙腈（色谱纯）：北京化学试剂公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐 [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、牛血清蛋白、维生素B12、谷胱甘肽及胶原蛋白：Sigma公司；Giemsa液：索莱宝公司。

Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 1100型氨基酸自动分析仪：美国安捷伦公司；MSM2013实验室用膜分离设备：上海摩速科学器材有限公司；UV-2010PC紫外可见分光光度计：尤尼克（上海）仪器有限公司；Versamax Tunable Microplate Reade光栅式恒温酶标仪：Versamax Tunable公司；BX43荧光显微镜：Olympus公司。

SPF级昆明小鼠：山东朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2 不同分子量松花肽的制备

将松花粉粕粉碎后配成溶液，调节pH值到12，在水浴中搅拌提取1 h后，4000 r/min转速下离心20 min，收集上清，调节pH值至4.5，离心，收集沉淀，加水复溶为2.5%的松花蛋白溶液，加入4 000 U/g胰蛋白酶，在pH8.5，50℃的条件下分别酶解60 min和240 min后，进一步将制备得到的各酶解产物分别利用实验室用膜分离设备通过管式超滤膜1 kDa～3 kDa和小于1 kDa两个分子量段超滤，进行样品的分离制备，并通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）验证其平均分子量，得到1 kDa～3 kDa和＜1 kDa的2组松花肽。

1.3 分子量分布的测定

使用TSK GEL G2000SWXL色谱柱，通过高效液相色谱测定2种松花肽的分子量分布。检测条件为：以体积比1∶1的乙腈与0.2%三氟乙酸混合溶液为流动相，按0.5 mL/min的流速过柱，紫外检测波长为225 nm。取牛血清蛋白、维生素B12、谷胱甘肽及胶原蛋白样品各1 mg，分别溶于1 mL的纯水中，用0.45 μm微孔滤膜过滤后进样。结果通过GPC软件进行分析。

1.4 氨基酸组成的分析

松花肽的氨基酸组成通过氨基酸自动分析仪进行检测。总氨基酸的组成分析：采用OPA柱前衍生反相高效液相色谱法测定。将松花肽置于水解管中，加入6 mol/L的HCl溶液，真空封口，在110℃下水解24 h，OPA柱前衍生（脯氨酸、羟脯氨酸是与氯甲基芴甲酯反应）后注入Agilent 1100型氨基酸自动分析仪测定氨基酸组成。游离氨基酸的组成分析：样品用等体积三氯乙酸沉淀，经过滤、离心后，取上清液注入Agilent 1100型氨基酸自动分析仪测定氨基酸组成。

1.5 动物分组与计量选择

选用6～8周龄，体重18g～22g的SPF级昆明种雌性小鼠进行试验。试验中两组松花肽各设3个剂量组，试验样品的推荐用量为每人每日6.0g，按60kg体重计，相当于0.1g/（d·kg·BW），按人体推荐量的5、10、20倍确定小鼠的低、中、高剂量，即各组小鼠每日剂量分别为0.5、1.0、2.0g/（kg·BW）。以人体推荐量的10倍为中剂量组，另设两个剂量组，分别为人体推荐剂量的5倍和20倍，另有一个空白对照组，以大豆肽为阳性对照组。即将试验动物分成8组，每组30只，分别为：阳性对照，1kDa松花肽低剂量，1 kDa松花肽中剂量，1 kDa松花肽高剂量，1 kDa～3kDa松花肽低剂量，1kDa～3kDa松花肽中剂量，1 kDa～3kDa松花肽高剂量和阴性对照。

1.6 刀豆蛋白A（concanavalin，ConA）诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验

按照《保健食品评价与检验技术规范》中的试验方法进行试验，各剂量组动物每组10只，连续灌胃一个月后颈椎脱臼法处死动物，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，研磨脾脏，制成当个细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hanks液洗2次，每次1 000 r/min离心10 min后悬浮细胞于RPMI1640完全培养液中，调整细胞浓度为3×106个/mL。将细胞悬液分两孔，每孔1mL，加入24孔培养板中，再加75 μL ConA 液（100 μg/mL），另一孔作为对照，置 37℃、5%CO2培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入 50 μLMTT（5 mg/mL），持续培养 4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。将溶解液移入96孔培养皿中，每孔做3个平行孔，用酶标仪在570 nm测定吸光值。

淋巴细胞增殖能力=加Con A的光密度值-不加Con A的光密度值

1.7 血清溶血素的测定

按照《保健食品评价与检验技术规范》中的试验方法进行试验，各剂量组动物每组10只，连续灌胃一个月后，每鼠腹腔注射20%压积绵羊红细胞（sheep red blood cells，SRBC）生理盐水细胞混悬液 0.2 mL，连续给药5 d，于最后一次给药后1 h，从小鼠眼眶静脉丛取血，离心分离血清，取血清用生理盐水稀释500倍，取稀释血清1 mL置试管中，加10%SRBC混悬液0.5 mL，置于冰浴中，再加入以生理盐水1∶10稀释的豚鼠血清1 mL混合，另设不加血清的空白对照。移置37℃恒温水浴保温10 min后，冰浴中终止反应。用2 000 r/min离心10 min后取上清1 mL，加入都氏试剂3 mL，混匀放置10min，取上清液于540 nm测吸光度值。另取10%SRBC混悬液0.25 mL与3.75 mL都氏试剂混合，540 nm测定OD值，作半数溶血值。

血清溶血素含量以半数溶血值（HC50）表示。按下式计算：

1.8 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

八组试验动物分别连续灌胃一个月后，每只鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 mL，间隔30 min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min，然后吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片载玻上，放入垫有湿沙布的搪瓷盒内，移置37℃孵育30 min后，除去未贴片细胞，晾干，以1∶1（体积比）丙酮甲醇溶液固定，4%（体积分数）Giemsa液染色3 min，再用蒸馏水漂洗晾干，油镜下计数巨噬细胞，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数：

1.9 数据统计

采用SPSS软件进行试验数据统计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 两种松花肽分子量的验证

HPLC及GPC软件分析得到松花肽的平均分子量及分子量分布按照试验条件酶解60 min时，得到的松花肽平均分子量为1 673 Da，能够较好的满足1 kDa～3 kDa松花肽的要求，通过超滤得到1 kDa～3 kDa松花肽；当酶解4 h时，平均分子量为784 Da，能够满足小于1 kDa松花肽的要求，通过超滤得到小于1 kDa松花肽。松花肽的分子量分布见表1。

表1 松花肽的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of pine pollen peptides

2.2 松花肽的氨基酸组成分析

对两种松花肽的氨基酸组成进行分析，各氨基酸具体组成含量如表2所示。

表2 松花肽的氨基酸组成表Table 2 Amino acid composition of pine pollen peptides

两种松花肽必需氨基酸含量分别为55.2%和57.0%。两种松花肽的必需氨基酸含量均高于联合国粮农组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，FAO/WHO）推荐值。并且与FAO/WHO提出的食物中推荐氨基酸需求相比，所有必需氨基酸的含量均高于FAO/WHO要求，可见其能够成为人类优质的蛋白质来源。

2.3 ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验

通过ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验探讨两种分子量的松花肽对细胞免疫功能的影响。细胞免疫功能中两个剂量组的结果为阳性，即可判定细胞免疫功能结果阳性。结果如图1所示。

图1 两种松花肽对小鼠细胞免疫活性的影响Fig.1 Effect of two kinds of pine pollen peptides on the cellular immune activity in mice

通过小鼠脾淋巴细胞转化试验探讨其对细胞免疫功能的影响发现，与阴性对照组相比，阳性对照组、1 kDa低剂量组、1 kDa中剂量组、1 kDa～3 kDa中剂量组和1 kDa～3 kDa高剂量组都存在极显著差异（P＜0.05）。说明在以上4个不同分子量和剂量组的松花肽样品具有极显著的增强ConA诱导的淋巴细胞增殖能力。按照小鼠脾淋巴细胞转化试验结果统计要求，说明两种松花肽均具有增强细胞免疫的活性。

2.4 松花肽对小鼠血清溶血素含量影响

松花肽对小鼠血清溶血素的影响反应了松花肽对小鼠体液免疫功能的影响。体液免疫功能中两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能结果阳性，结果见图2。

图2显示，与阴性对照相比，除＜1 kDa松花肽高剂量组差异不显著外，其他试验组以及阳性对照的半数溶血值均极显著增加，说明两个分子量松花肽均具有增强体液免疫力活性。

2.5 松花肽对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

图2 松花肽对小鼠血清溶血素含量的影响Fig.2 Effect of pine pollen peptides on blood-serum erythrocytolysin in mice

松花肽对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力体现了松花肽对小鼠的单核-巨噬细胞免疫功能的影响。若其中两个剂量组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞免疫功能结果阳性。对染色的涂片通过显微镜逐一计数巨噬细胞以及吞噬鸡红细胞数量，结果如图3所示。

图3 松花肽对小鼠单核-巨噬细胞免疫功能的影响Fig.3 Effect of pine pollen peptide on mononuclear-macrophage immune function

与阴性对照组相比，阳性对照组、1 kDa松花肽的3个剂量组和1 kDa～3 kDa 3个剂量组都存在极显著差异（P＜0.05）。按照巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果统计要求，说明两个不同分子量和剂量组的松花肽样品具有极显著的增强巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力，即两种松花肽均具有增强单核-巨噬细胞免疫活性的功能。

综合以上试验结果，两种分子量的松花肽均具有增强细胞免疫功能、体液免疫功能和单核-巨噬细胞功能的作用。按照《保健食品评价与检验技术规范》要求，对增强免疫力的功能判定要求为，在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性4个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能。因此，1kDa松花肽和1kDa～3 kDa松花肽均具有增强免疫力功能。

3 结论

平均分子量在1 kDa～3 kDa和小于1 kDa的两种分子量的松花肽均具有增强细胞免疫功能、体液免疫功能和单核-巨噬细胞功能的作用，因此，1 kDa松花肽和1 kDa～3 kDa松花肽均具有增强免疫力功能。