五峰绿茶的体外抗氧化活性研究

袁晓擘，李世刚，张宏岐，，陈思才，柳蔚，，*

（1.三峡大学医学院，湖北宜昌443002；2.三峡大学茶叶研究所，湖北宜昌443002）

酪氨酸酶与多种疾病密切相关，如人体皮肤色素障碍性疾病、黑色素瘤、帕金森病、神经退行性疾病、白化病等[1-2]。酪氨酸酶抑制剂在医疗美容、食品保鲜、农业害虫防治、生物抗菌等行业中具有重要的应用价值[3]。研究表明，抑制氧自由基对酪氨酸酶的激活作用，是酪氨酸酶抑制剂的主要作用机制之一[4]。当体内自由基产生过多，或抗氧化体系衰减时，机体自由基逐渐累积，自由基上的孤对电子能够与细胞内的大部分物质发生化学反应，损害细胞功能，促进和参与多种疾病的发生发展。调节机体代谢、防治活性氧对机体侵害性疾病的新型抗氧化剂的开发，已成为现今的研究热点之一。

植物次生代谢产物熊果苷、槲皮素、橙皮苷、柚皮素等均有酪氨酸酶抑制活性[5-6]，其中甘草提取物应用最广[7]，但却受限于植物资源和生态环境的限制。茶叶是天然的抗氧化剂，具有清除氧自由基、防治动脉粥样硬化、预防老年痴呆、降低血脂血糖和体重并延缓衰老等功效[8]。金亮等[9]研究六大类19个知名茶叶的抗氧化活性，发现茶叶种类不同其抗氧化活性不同，相关性分析表明茶汤颜色、抗氧化活性与茶叶总酚含量呈正相关。

五峰土家族自治县位于鄂西南边陲，武陵山支脉地貌使其生产的五峰绿茶（wu-feng green tea，WGT）富有独特的口感，素有“中国茶叶之乡”的美称。绿茶富含多酚类、氨基酸类、生物碱类、多糖类及其他微量元素和矿物质等多种成分，经常饮用不仅有提神醒脑、补充营养等作用，还具有抗菌抗病毒、抗三高及防癌抗突变等多种功效。本试验采用ABTS法、DPPH法、对O2-·的清除能力、对三价铁离子的还原能力来测定五峰绿茶提取物的抗氧化作用，为其应用及进一步研发提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

N-1001S-W旋转蒸发仪器：日本东京理化器械株式会社EYELA；InfiniteR200 Pro NanoQuant酶标仪：瑞士Tecan公司；Eppendorf Centrifuge 5804 R离心机：德国艾本德股份公司。

酪氨酸酶（酶活力≥1 000 U/mg）、左旋多巴（levodopa，L-DOPA）：美国 Sigma-Aldrich 公司；维生素 C（抗坏血酸）：天津市天力化学试剂有限公司；对1，1-二苯基-2-苦基肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源叶生物科技有限公司；2，2-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海金穗生物科技有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、乙酸、高硫酸钾、Tris-HCl、邻苯三酚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

五峰绿茶：湖北五峰白溢春茶业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 WGT粗提物制备

称取绿茶250 g，粉碎后置于圆底烧瓶中，加入2 500 mL蒸馏水加热回流1 h。提取3次，合并提取液，旋转蒸发仪浓缩至200 mL左右时水浴干燥，测得提取量为82.14 g（得率32.86%）。

1.2.2 DPPH自由基清除试验

精确称取DPPH固体3.95 mg，用95%乙醇充分溶解定容至10 mL制备为工作液。分别取DPPH工作液60 μL，与60 μL不同浓度的样品溶液混合暗处静置30分钟后，517 nm测其吸光值，计算其清除率。试验以95%乙醇为空白对照组，维生素C为阳性对照组[10]。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1为样品溶液的吸光度；A2为等量95%乙醇代替DPPH溶液的吸光度；A0为等量95%乙醇代替样品溶液的吸光度。

1.2.3 ABTS+自由基清除试验

分别取ABTS（7.4 mmol/L）溶液和过硫酸钾（2.6 mmol/L）溶液各0.2 mL充分混合，室温避光静置12 h，制备成ABTS+自由基储备液。试验时分别取ABTS+自由基储备液、95%乙醇-样品溶液各 80 μL，充分混合10 min，734 nm下测定吸光值。

式中：A1为样品溶液的吸光度；A2为等量蒸馏水代替样品溶液的吸光度。

1.2.4 铁氰化钾法测定五峰绿茶总提物的还原能力

取一系列不同浓度样品溶液各100 μL，加入0.2 mol/L（pH 6.6）磷酸盐缓冲液和1%铁氰化钾溶液各100 μL，50℃保温20 min后急速冷却，加入10%三氯乙酸 100 μL，3 000 r/min离心10 min获得上清溶液。取上清液50 μL，加入蒸馏水和0.025%氯化铁各50 μL，充分混匀，静置10 min。测定700 nm处的吸光值，吸光值越大还原力越强。试验以蒸馏水为空白对照组，维生素C为阳性对照组。

1.2.5 超氧阴离子清除能力的测定

向96孔板分别加入60μL的Tris-HCl（50mmol/L，pH 8.2） 溶液、30 μL的不同浓度样品溶液和 15 μL的邻苯三酚-HCl（3 mmol/L）溶液，混匀后25℃水浴5 min，加入10 μL的HCl（10 mol/L）终止反应，420 nm下检测各浓度吸光度值。以蒸馏水为空白对照，以维生素C作为阳性对照组。每个样品重复3次取均值，按公式计算清除率。

式中：A0为空白对照管吸光度；A1为待测管吸光度；A2为等量蒸馏水代替邻苯三酚-HCl溶液的本底吸光度。

1.2.6 酪氨酸酶抑制率检测

以磷酸缓冲液（25 mmol，pH 6.8）为溶剂，配置L-DOPA底物溶液0.1 mg/mL、酪氨酸酶溶液（50 U/mL）以及其他溶液。用陈景明[11]报道的方法，96孔板中设置200μL总反应体系，分别加入40μL底物溶液、80μL磷酸缓冲液、40 μL样品溶液，混匀后加入40 μL酪氨酸酶溶液，于25℃温孵10 min，490 nm下测定吸光度。

计算公式：酪氨酸酶抑制率/%=1-[（A1-A2）/（A3-A0）]× 100

式中：A1为样品溶液吸光度；A2为等量蒸馏水代替酪氨酸酶溶液的吸光度；A3为为等量蒸馏水代替样品溶液的吸光度；A0为等量蒸馏水代替样品溶液和酪氨酸酶溶液的吸光度。

1.2.7 数据处理

采用SPSS20.0计算IC50值，采用GraphPad Prism 5作图。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除效果

DPPH自由基化学性质较稳定，其乙醇溶液为深紫色，在517 nm处有强吸收。绿茶抗氧化成分与DPPH自由基的单电子配对可使DPPH-乙醇溶液褪色，褪色程度与DPPH自由基接受的电子数量成正比关系。试验结果如图1所示。

图1 五峰绿茶清除DPPH自由基能力Fig.1 The scavenging effects of WGT on DPPH free radical

由试验结果可知，绿茶总提物具有剂量依赖性的DPPH自由基清除活性。在试验浓度范围内，比较绿茶总提物和维生素C清除DPPH自由基的能力，IC50值分别为50.561 μg/mL和16.046 μg/mL，最大清除率分别为92.5%和95.6%。由此看出，绿茶总提物在DPPH自由基的最大清除率上和维生素C相近，但所需剂量是维生素C的3倍。

2.2 ABTS+自由基清除效果

ABTS+自由基被氧化后呈绿色溶液，在734 nm处有最大吸收峰。绿茶提取物抑制ABTS+自由基的氧化，氧化产物的减少与溶液颜色成正比关系。因而检测溶液吸光度的改变，反映出绿茶提取物的抗氧化能力。试验结果如图2所示。

图2 五峰绿茶清除ABTS+自由基能力Fig.2 The scavenging effects of WGT on ABTS+free radical

由试验结果可知，绿茶总提物具有很强的ABTS自由基清除活性，具有一定的量效关系。在试验浓度范围内，比较绿茶总提物和维生素C清除ABTS+自由基的能力，IC50值分别为 8.811 μg/mL 和 5.753 μg/mL，最大清除率分别为100.0%和99.7%。由此看出，绿茶总提物在DPPH自由基的最大清除率上和维生素C相近，且所需剂量与维生素C相近。

2.3 五峰绿茶总提物还原能力的测定

通常抗氧化剂具有还原能力，因而通过给出电子以清除自由基；还原能力越强，抗氧化能力越强。铁氰化钾（三价铁）如被还原成为亚铁氰化钾（二价铁），还原产物亚铁氰化钾能够与三氯化铁反应生成普鲁士蓝，在700 nm处有最大吸光度，该吸光度的高低即可反映绿茶提取物的还原能力。试验结果如图3所示。

图3 五峰绿茶的还原能力Fig.3 The Reducing power of WGT

由试验结果可知，绿茶总提物具有很强的还原能力，具有一定的量效关系。在试验浓度范围内，比较绿茶总提物和维生素C的还原能力，IC50值分别为87.548 μg/mL 和 7.832 μg/mL，最大清除率分别为96.3%和96.8%。由此看出，绿茶总提物的最大还原能力的和维生素C相近，但所需剂量是维生素C的12倍，相差较大。

2.4 超氧阴离子自由基（O2-·）清除效果

邻苯三酚在pH 8.30的Tris-HCl中自发发生氧化反应，生成的O2-·在420 nm处产生吸收峰。通过检测吸收峰的变化，反应五峰绿茶抑制邻苯三酚自氧化的能力。试验结果如图4所示。

图4 五峰绿茶清除氧自由基能力Fig.4 The scavenging effects of WGT on superoxide anion free radical

由试验结果可知，绿茶总提物具有超氧阴离子自由基清除能力，且具有一定的量效关系。在试验浓度范围内，比较绿茶总提物和维生素C的O2-·清除能力，IC50值分别为 196.095 μg/mL 和 5.245 μg/mL，最大清除率分别为57.3%和97.6%。由此看出，绿茶总提物对超氧阴离子自由基的清除能力有限，和维生素C相比相差较大。

2.5 酪氨酸酶活性检测

酪氨酸酶催化底物多巴产生多巴醌，再继续氧化成的黑色素在475 nm波长有吸光度。以每分钟增加0.001为一个酶活力单位。绿茶总提物具有抗氧化能力，因而可抑制该氧化反应减少黑色素的生成，使吸光度降低。试验结果如图5所示。

图5 五峰绿茶抑制酪氨酸酶活性Fig.5 Inhibitory effects of WGT on tyrosinase activities

由试验结果可知，五峰绿茶总提物对酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，该作用呈现一定的量效关系，但其最大抑制率仅为36.259%，说明绿茶总提物对酪氨酸酶的抑制作用较弱。刘锦梅等[12]发现，崂山绿茶、福建花茶、福建铁观音、云南普洱茶的醇提物能够抑制土豆酪氨酸酶活性，其中崂山绿茶对酪氨酸酶活性的抑制率为9.50%。但是崂山绿茶抑制酪氨酸酶活性9.50%。本研究发现，五峰绿茶也具有酪氨酸酶活性抑制作用，较刘锦梅测试崂山绿茶所得抑制率更高，可能是两种茶叶中具有抑制酪氨酸酶活性的主要成分茶黄素含量不同所致[13]，也可能是因为酪氨酸酶来源不同所致，具体原因有待于进一步试验研究。

3 结论

本试验采用4种体外检测体系研究五峰绿茶抗氧化能力，其活性顺序为清除ABTS+自由基＞清除DPPH自由基＞还原能力＞清除超氧阴离子自由基。试验结果证明，五峰绿茶在一定浓度范围内确实具有较好的剂量依赖性的体外抗氧化能力和酪氨酸酶抑制活性。然而对不同自由基的清除能力不同，特别是对超氧阴离子自由基的清除能力差强人意，可能是因各体系原理不同所致[14]。