转 TaSCL14基因小麦的遗传稳定性及农艺性状分析

牛艳路，朱 浩，王 佩，陈坤梅，李宏伟，陈耀锋

(1.西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100； 2.中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 100101； 3.中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙 410205)

作物的产量主要来自光合作用的物质积累，但植物的光能利用率仅为1%～2%[1]，因此选育高光效品种来提高作物的光能利用率是提升作物产量的有效途径。但传统的育种方法育种年限长且利用的基因有限，而转基因技术的发展大大缩短了育种周期，为小麦基因资源的利用、种质创新和品种改良开辟了新的途径和方法。1992年，世界第一株转基因小麦诞生[2]，此后小麦转基因技术不断发展优化，目前作物转基因技术已涉及抗病虫[3]、抗逆[4]、品质改良[5]和产量提高[6-7]等多方面。因此，可以利用转基因技术将高光效基因转入小麦品种，结合传统育种方式，选育高光效种质。有研究发现，将高光效丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因转入籼稻，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因转入水稻、小麦和大豆等作物均能够引起转基因植株的产量或光合特性的提高[8-11]。

GRAS蛋白是存在于多种高等植物中的重要的转录因子，GRAS的名字来源于最初被发现的三个功能成员GIBBERELLICACIDINSENSITIVE(GAI)、REPRESSOROFGAI(RGA)和SCARECROW(SCR)[12]。它有8个亚家族：DELLA、LISCL、HAM、PATI、SCR、LS、SCL3和SHR，在植物分生组织形成、光、赤霉素信号传导、生长发育、生物及非生物胁迫过程中起着重要的作用[13-14]。目前，已在水稻[15]、葡萄[16]、胡杨[17]、佛手[18]、枳[19]和烟草[20]等多种植物中发现GRAS家族基因。1996年，SCR基因在拟南芥中被克隆，该基因在拟南芥侧根形成上起关键作用[21]。2010年，Ma等[17]克隆了胡杨中的一个GRAS基因PeSCL7，转PeSCL7基因的拟南芥对干旱和盐的耐受性显著增强。2015年，陈坤梅等[22]从小麦品种小偃54中筛选并克隆了强光效应基因TaSCL14，并证实TaSCL14基因是小麦GRAS转录因子家族的一员；利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术将TaSCL14基因沉默，发现小麦植株的生物量下降，净光合速率降低，并通过基因枪介导法将TaSCL14基因导入普通小麦品种小偃39中，获得了一批转TaSCL14基因的小麦植株。为了获得农艺性状优良的转TaSCL14基因小麦品系，本研究在此基础上，采用普通PCR和qRT-PCR技术分析转TaSCL14基因小麦后代中外源基因的遗传稳定性，并对主要的农艺性状特性进行分析，以期为该基因在高光效品种改良中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为普通小麦小偃39以及以小偃39为受体通过基因枪转化法获得的转TaSCL14基因的T1～T3代植株。转基因后代分别于2015-2016和2016-2017年度种植于陕西省杨凌示范区西北农林科技大学转基因材料试验田，四周设置保护行，按田间常规管理。

1.2 PCR检测

在转基因小麦拔节期进行取样，CTAB法提取基因组DNA，根据TaSCL14基因全长及载体序列设计正反向引物进行基因组DNA分子检测。正向引物F:5′-GCCGTGGATGACAGTG AGA-3′，反向引物 R：5′-TAATACGACTCACT ATAGGG-3′。PCR扩增体系与程序参考TaqDNA聚合酶(TaKaRa，日本)说明书，其中循环数为35，退火温度为55 ℃，延伸时间为2 min，扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 RNA的提取和qRT-PCR

植物总RNA提取参照植物总RNA小量提取试剂盒(美基生物，广州)说明书进行。RNA提取后用1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测完整性，反转录采用PrimerScriptTMII 1st strand cDNA synthesis Kit(TaKaRa，日本)。以反转录得到的 cDNA为模板，目的基因的引物序列为F：5′-CGAGGAGACGGGGCACAGG-3′，R：5′-CGTC CATCAGGTGCCTGAAGTGAC-3′；小麦Actin基因作为内参，内参引物序列为F：5′-TGTTGT TCTCAGTGGAGGTTCT-3′，R：5′- CTGTAT TTCCTTTCAGGTGGTG-3′，在ABI PRISM 7700荧光定量PCR仪(ABI，美国)上进行qRT-PCR。反应体系与程序参考2×SuperReal Color PreMix(天根生化，北京)说明书，其中循环数为40，退火温度为60 ℃，退火时间为45 s。反应结束后，通过熔解曲线分析确认扩增的特异性。每个样品3次技术重复，试验共设3次生物学重复，根据2-ΔΔCT法计算TaSCL14基因的相对表达量。

1.4 转基因植株农艺性状调查

2015年10月种植转TaSCL14基因T1、T2代株行，以受体小麦小偃39为对照，T2代经由前一年筛选T1代阳性单株得到，行长1 m，行距0.2 m，株距20 cm。在小麦进入越冬期停止分蘖后调查的分蘖作为冬前分蘖，在年后小麦起身前调查的分蘖作为冬后分蘖，分蘖芽从基部叶腋内伸出2 cm作为分蘖的计数标准。植株成熟后调查全部植株的株高、有效分蘖、穗长、小穗数、穗粒数和千粒重。选择T2代农艺性状表现优良且筛选为阳性植株的4个株系于2016年10月按株系种植作为T3代，每个株系种植5行，行长1.5 m，行距0.2 m，株距5 cm，随机区组排列，3次重复，每次重复包含2个受体对照。幼苗期每个小区随机调查15株小麦的冬前和冬后分蘖情况，成熟后从每个小区抽取10株，测量T3代小麦各个株系的农艺性状以及每平方米穗数用于测产。

1.5 数据处理

数据处理及分析使用软件Excel 2010和SPSS 22.0进行。

2 结果与分析

2.1 转 TaSCL14基因T1、T2代植株的PCR检测及农艺性状分析

2.1.1 转TaSCL14基因T1、T2代植株的PCR检测结果

T0代得到56个单株，经筛选，T0代单株所结种子种植为株行，T1代种植40个株行，共170株；T2代种植62个株行，共236株。转基因小麦T1代和T2代植株PCR检测结果表明，所有阳性植株均扩增到约1 700 bp的特异片段，而阴性植株和对照(小偃39)中无特异条带(图1)。通过统计共检测出阳性植株297株，其中T1代95株，T2代202株，阳性率分别为55.9% 和85.6%。

2.1.2 转TaSCL14基因小麦T1、T2代主要农艺特性

调查结果(表1)表明，对照小偃39及转基因T1、T2代在冬后分蘖数、有效分蘖数、株高、穗长、小穗数和千粒重等主要农艺性状上均无显著差异，但T1代转基因植株的穗粒数显著低于对照；T2代转基因植株的冬前分蘖数显著高于对照。T1、T2代的千粒重略低于对照，T2代的农艺性状整体优于T1代。

M：DL2000 ；1：对照(小偃39)；2～9：阳性植株；10：阴性植株。

M:DL2000; 1:CK(Xiaoyan39); 2-9:positive plants; 10:negative plant.

图1 转基因植株中 TaSCL14基因的PCR扩增结果

*表示在0.05水平上与对照差异显著。下同。

* indicates significant difference with CK at 0.05 level.The same in the following tables.

把T1、T2代各阳性单株的农艺性状与对照小偃39进行比较，分析各性状高于和低于对照的植株数量占各世代植株总数的比例以及各性状均值与对照的差异程度，结果(表2)表明，T1、T2代阳性植株的冬后分蘖数平均比对照多4.26个和5.03个，高出了对照33.89%和40.10%，差异较大，表明该基因的转入对冬后分蘖的影响较大。此外，T1代中千粒重高于对照的植株数仅占26.19%，而千粒重低于对照的植株数占73.81%，在T2代这两个值分别为21.05%和78.95%，这表明TaSCL14基因的转入对转基因小麦T1、T2代千粒重主要产生负效应。同时，发现从T1代到T2代各农艺性状高于对照的植株占比在上升。

表2 T1、T2代植株农艺性状与对照的比较Table 2 Comparison of agronomic characters between T1 and T2 plants and controls

2.2 转 TaSCL14基因T3代植株分子检测及农艺性状分析

2.2.1 转TaSCL14基因T3代植株分子检测结果

对4个来源不同的转TaSCL14基因T3代株系3-4、3-7、3-8和3-11及对照小偃39，在拔节期每个株系和对照随机选取10株提取基因组DNA，进行PCR检测，结果(图2)显示，对照株系小偃39中不能扩增出目的条带，而转基因株系全部可以扩增到约1 700 bp的特异片段，说明4个转基因株系阳性率能达到90%以上，表明这4个转基因株系已基本纯合。

M:DL2000；1～4:株系3-4、3-7、3-8、3-11；5:对照(小偃39)。

M:DL2000; 1-4:Line 3-4, 3-7, 3-8, 3-11; 5:CK(Xiaoyan 39).

图2转基因T3代株系的PCR检测结果

Fig.2PCRampliconfromtransgenicT3strains

为了研究TaSCL14基因在转基因后代的表达情况，对不同的转基因T3代株系和对照材料在幼苗期取样进行qRT-PCR。结果(表3)表明，4个转基因株系3-4、3-7、3-8和3-11的表达水平均高于对照，且与对照呈极显著差异。

2.2.2 转TaSCL14基因T3代小麦农艺性状分析

4个转基因株系在T3代整个生育时期各项农艺性状的观测结果(表4)表明，转基因各株系的冬前分蘖数、冬后分蘖数和有效分蘖数都高于对照，其中转基因株系3-7的冬前分蘖数与对照存在极显著差异，株系3-11与对照存在显著差异；转基因株系3-7的冬后分蘖数与对照存在极显著差异，株系3-4与对照存在显著差异。4个转基因株系有效分蘖数的变化范围为7.3～8.5，平均比对照高2.68个；差异显著性分析表明，转基因株系3-4与对照存在显著差异，株系3-7和3-11均与对照存在极显著差异，表明目的基因的导入对T3代3-4、3-7和3-11株系分蘖的影响较为明显。各株系小穗数均比对照上升，株系3-4的小穗数与对照存在显著差异。但各转基因株系的株高和穗长均与对照不存在显著差异。

表3 转基因株系及其对照 TaSCL14基因的相对表达量Table 3 Relative expression of TaSCL14 gene in transgenic lines and their control

**表示与对照差异极显著(P<0.01)。下同。

** indicates significant difference with CK at 0.01 level.The same in the following tables.

T3代中4个转基因株系的每平方米穗数和穗粒数都高于对照，穗粒数平均高3.39粒，但差异不显著。转基因株系的千粒重均不同程度的比对照下降，平均下降了2.73 g，株系3-7极显著低于对照。但转基因株系3-4、3-8和3-11的理论产量高于对照，这与它们每平方米穗数和穗粒数的增加有关(表5)。

表4 T3代转基因株系的农艺性状Table 4 Agronomic traits of transgenic wheat lines in T3 plants

表5 T3代转基因株系的产量性状Table 5 Yield traits of transgenic wheat in lines of T3 plants

3 讨 论

近年来植物转基因技术研究发展迅速，抗除草剂大豆和油菜、抗虫玉米和棉花等转基因品种已有商业化种植[23]，取得了巨大的经济和社会效益。小麦是异源六倍体植物，基因组相对较大，遗传背景复杂，这造成了它的转化难度较大。外源基因能否在转基因小麦中稳定的遗传表达是转基因小麦具有研究价值的关键。本研究发现外源基因TaSCL14在转基因小麦T1～T3代中都能够被检测到，这证实了转基因植株的真实性。目的基因TaSCL14在连续多代中都能被检测到，这同王军卫[24]等研究转基因后代的遗传表现相一致，表明目的基因能在后代中稳定遗传。成功转入外源基因的转基因后代的农艺性状除受品种本身的遗传特性影响外，还与种植条件和种植环境有关。李陈建等[25]研究T4代转sGNA基因小麦株系在大田条件下的生长情况发现转基因株系的生长特性未发生改变，个体正常生长发育，但千粒重和小穗数达到了显著水平。闫海生等[26]进行转OsCYP2基因水稻的研究，发现转基因植株的分蘖数明显增加，但是穗粒数、千粒重等多个性状表现低于对照。实验室在前期研究中发现，TaSCL14基因沉默会致使小麦沉默株系植株变得矮小、分蘖数和叶片数减少，生物量下降，光合性能降低。而TaSCL14基因在拟南芥中的过表达能提高转基因植株的产量和光合特性[22]。

本试验发现，在田间栽培条件相同的情况下，转TaSCL14基因小麦植株能够正常生长发育，植株的形态特征与对照相比变化不大，但在转基因小麦后代的分蘖、小穗数、穗粒数和千粒重等方面均发生了一些变化。转基因植株T1代的穗粒数、T2代的冬前分蘖数都与对照存在显著差异，T1、T2代均有75%左右的转TaSCL14基因植株千粒重低于对照，可见TaSCL14基因的转入对大多数植株的千粒重呈现负效应。TaSCL14基因在T3代的四个转基因株系中都过表达，4个转基因株系的株高、穗长、穗粒数与对照无差异，大多数株系的各时期分蘖数都显著或极显著高于对照，千粒重都低于对照，可见转入基因过表达对于分蘖和千粒重的影响较大。这与T1和T2代的田间农艺性状表现也基本一致。秦保平等[27]对于转Hpa110-42基因小麦株系的研究发现，转基因各株系小穗数和千粒重显著上升；王瑞霞等[28]对转反义PLDγ基因小麦的研究发现，转基因株系的株高、千粒重、单株穗数与受体相比显著增加，这和本研究结果(T1～T3代株高与对照无差异，千粒重下降)有所不同，可能是因为转基因使用的受体材料、外源基因的种类、基因整合位点、整合的拷贝数等存在差异[29-30]。同时，本研究也发现，转基因T2代植株总体的农艺性状要优于T1代植株，T3代各株系的农艺性状要整体优于对照，这可能是由于在转基因高代目的基因的分离已基本趋于稳定，因此转基因植株的性状也较为稳定。

本研究表明，外源TaSCL14基因的导入能够影响小麦转基因后代的部分农艺性状，随着筛选世代的增加，基因的遗传表达趋于稳定且株系间的表达量存在差异。由于TaSCL14基因属于转录因子基因且是一个强光响应基因，所以调查转基因小麦田间农艺表现和筛选出稳定转基因株系对后期进一步探究该基因对于小麦光合特性影响具有重要意义。