油菜素内酯对小麦幼苗根系发育的影响

邓 茜，张爱华，侯立江，王 丹，许盛宝

(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

小麦(TriticumaestivumL.)是世界上重要的粮食作物之一，保障小麦高产稳产是我国乃至全世界当前重要的课题。小麦根系在其整个生长发育过程中扮演着非常重要的角色，特别是早期根的数目、总根长和侧根的数目，对于小麦产量影响较大[1-2]。

油菜素内酯(brassinolide, BL)是活性最强的一种甾醇类植物激素(brassinosteroids,BRs)[3-7]。BRs参与植物一系列的生长发育过程，如胚根和胚轴的伸长、叶片伸展、基因表达调控、开花和结果、细胞程序性死亡等，最典型的就是作用于细胞的伸长和分裂[3-4]，以及参与植物对各种生物或非生物胁迫耐受过程[5-6]。在拟南芥中，BRs不仅参与根细胞伸长，而且还参与根系发育的许多方面，例如根毛形成、侧根起始、菌根形成、根细胞分裂和根分生组织原生韧皮部的分化[8-9]。目前，关于BRs对小麦根系影响的研究较少，限制了其在小麦中的应用。研究表明，BRs对小麦种子的萌发[10]、幼苗抗冷性[11]、抗旱性[12]以及萌发期间抗盐性[13]具有重要的调控功能。在小麦孕穗期和灌浆期，喷洒低浓度BL可以增强植株抗青枯能力，降低不育小穗数，提高结实率和粒重[14]。BL浸种可促进小麦根和胚芽鞘的伸长，并增加干物质量[15]。先前的研究也观察到，BRs对小麦根系发育有调控功能[16]。此外，在小麦根系发育中，细胞伸长和增殖是紧密相关的，而BR对细胞增殖的影响更为突出[17-19]，但需要系统的研究来阐明BR在小麦根系发育中的具体功能，从而促进油菜素内酯在小麦根系改良中的应用。

本研究通过水培方法探究了不同浓度的BL及BRs合成抑制剂BRZ对小麦幼苗根系的形态、长度、直径和侧根原基、侧根及其长出速率的影响，以期解析BRs在小麦根系发育的调控功能，为利用BRs的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小麦(TriticumaestivumL.)品种为中国春和辽春10号。

1.2 试验设计与方法

1.2.1 小麦幼苗的水培

精选饱满种子在蒸馏水中浸泡5～8 h，用消毒液(绿伞)对种子进行表面消毒(消毒液∶蒸馏水=3∶2)5～6 min，然后用蒸馏水冲洗5～7次。在灭菌的培养皿(直径15 cm)中铺两层滤纸，加入5 mL蒸馏水润湿，将冲洗干净的种子均匀地摆放在滤纸上，再缓慢加入15 mL蒸馏水，盖上盖子，置于4 ℃ 条件下春化24 h。然后在白天 23 ℃、晚上 20 ℃、光/暗时间14 h/10 h、光强 110 μmol·L-1·m-2·s-1、湿度 60%～70% 的光照培养箱中培养，大概 12 h 后露白，培养2 d 后将长势一致的幼苗作为实验所用材料，并移至发芽盒(12 cm×12 cm)。每个发芽盒中放20株，发芽盒用保鲜膜覆盖，在保鲜膜上戳孔，以保证小麦的根系可以正常的呼吸。

1.2.2 小麦幼苗的处理

发芽盒中恢复生长一天后，开始用不同浓度BL(0 nmol·L-1、5 nmol·L-1、25 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1)和BRs合成抑制剂BRZ(100 nmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1)处理。每种处理设置 3 次重复，每次重复取15～20株长势一致的幼苗进行观察和测定，处理溶液每 2 d更换1次。所有处理均放置于光照培养箱中，培养条件同上。

1.2.3 亚甲基蓝染色

将切下的根固定在无水乙醇∶冰醋酸溶液(3∶1，v/v)中，4 ℃下至少24 h；之后用蒸馏水漂洗5 min，并浸泡在次氯酸钠溶液(5%，v/v)中抽真空10 min，再置于大气下 10 min；倒掉次氯酸钠溶液，用蒸馏水清洗干净；最后用亚甲基蓝(0.01%，溶解于蒸馏水中)染色[20]。经过亚甲基蓝染色的小麦幼苗，侧根和侧根原基处显色会明显加深，便于观察和统计。

1.2.4 试剂

试验所用的BL和BRZ均购买于上海Sigma-Aldrich公司。BL 用乙醇配成 10 mmol·L-1的母液，根据需要按一定的比例用蒸馏水稀释配成浓度为 0 nmol·L-1、5 nmol·L-1、25 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1的使用液，其中0 nmol·L-1是对照；BRZ 用DMSO配制成 10 mmol·L-1的母液，其使用浓度为 100 nmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1。

1.4 幼苗根系的观察与测定

用BL和BRZ 处理 10 d后，观察小麦幼苗根系的外形，并用数码相机(Canon eos 600d)对小麦幼苗的根系进行拍照，并用 Image-J软件测量小麦幼苗最长的根长。每个处理统计 20 株种苗并求平均值，每个处理重复 3 次。

小麦种子根经亚甲基蓝染色后，在体视显微镜(Nikon SMZ1500)下观察并记录侧根数目，每个处理统计 20 株幼苗并求平均值，每个处理重复 3 次。在距小麦幼苗根尖 1 cm 位置处徒手切片，并在ZEISS生物荧光显微镜(Imager M2)下观察、拍照，测量其直径。由于在本实验时期小麦幼苗根系数目在5～7根之间，所以小麦幼根初始原基数目及其长出速率测定时均将小麦最中间的三个根作为统计对象。侧根原基长出速率用同一时间点已长出的侧根与初始侧根原基数目的比值来表示。

1.5 数据处理

试验数据均用Microsoft Excel 2010进行整理、分析和作图，用SPSS 17.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 BL对小麦幼苗根形态的影响

在不同浓度BL和BRZ处理后，小麦幼苗地上部分形态没有明显的变化，但是根系形态发生了严重扭曲，根长、根直径和侧根数目也发生不同程度的变化(图1)。

2.2 BL对小麦幼苗根长的影响

低浓度BL促进了小麦幼苗根系伸长，但高浓度BL抑制了小麦幼苗根系生长(图2A和图2B)。其中，中国春的根长在5 nmol·L-1BL处理下较0 nmol·L-1处理(对照)极显著增加，但是BL浓度增加至100 nmol·L-1和1 μmol·L-1时，根长的生长又受到极显著的抑制。100 nmol·L-1和1 μmol·L-1BRZ处理对中国春根长没有显著影响，直到BRZ浓度增加到10 μmol·L-1时中国春幼苗根系的伸长才被明显抑制。辽春10号受BL和BRZ影响的趋势和中国春基本一致。

植物根系的生长主要是因为分生区细胞的分裂和伸长区细胞的扩张[21]。不同浓度BL及BRZ处理对两个小麦品种的幼苗根长均产生了影响。不同处理下两个小麦品种幼苗的成熟细胞长度和根长的表现基本一致(图2C和图2D)。在5 nmol·L-1BL处理下成熟细胞长度最大，与对照相比显著增加；但是根分生区域的细胞长度随着BL浓度的增大受到的抑制越来越严重(图2E和图2F)。由此可知，BL主要通过调控根成熟细胞长度来影响小麦幼苗根系长度。

1～5 分别表示0 nmol·L-1、5 nmol·L-1、25 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1BL处理；6～8 分别表示100 nmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1BRZ处理。下图同。

1～5 represent BL concentrations of 0 nmol·L-1, 5 nmol·L-1, 25 nmol·L-1, 100 nmol·L-1and 1 μmol·L-1, respectively, and 6～8 represent 100 nmol·L-1, 1 μmol·L-1and 10 μmol·L-1BRZ, respectively. The same in the other figures.

图1不同浓度BL和BRZ处理对小麦幼苗生长发育的影响

Fig.1EffectsofdifferentconcentrationsofBLandBRZongrowthanddevelopmentofwheatseedlings

2.3 BL对小麦幼苗根尖解剖结构的影响

从小麦幼苗根尖的横切结构(图 3)看，与对照相比，BL处理浓度越大，根系直径越小；而不同浓度BRZ处理均使根系直径增加。根尖维管柱内分化出木质部，且皮层细胞层次清晰、排列整齐，内皮层细胞“马蹄”型加厚非常明显，维管柱的结构与对照没有特别明显的差异(图 3A和图3C)；两个品种根细胞大小出现了很明显的差异。根据以上结果推测，BL可能通过影响根系皮层细胞大小来影响小麦幼苗根的粗细。

2.4 BL对小麦幼苗侧根数目的影响

在BL处理下中国春和辽春10号幼苗的侧根数目与对照均存在肉眼可见的差异(图1、图4A和图4B)。随着BL处理浓度的增加，两品种幼苗的侧根数目均极显著增加(图4C和图4D)；BRZ总的说来会抑制幼苗侧根数目。其中中国春侧根数目在100 nmol·L-1BL处理下最多，而辽春10号在5 nmol·L-1BL处理下最多。

图柱上的大小写字母分别表示处理间差异在0.01和0.05水平上显著。下图同。

Different capital and lower-case letters mean significantly different among the treatments at 0.01 and 0.05 levels. The same in figures 3-5.

图2不同浓度BL和BRZ处理对小麦幼苗根长、成熟细胞长度和根分生区长度的影响

Fig.2EffectsofdifferentconcentrationsofBLandBRZonrootlength,maturecelllengthandrootmeristemsizeofwheatseedlings

2.5 BL对小麦幼苗侧根原基及其长出速率的影响

侧根的数目决定于侧根原基起始数目及侧根原基长出的速率[22]。由图5A和图5B可知，中国春的幼苗用100 nmol·L-1及以下浓度的BL处理时，其起始侧根原基数相比于对照显著增加，但是当BL浓度增加到1 μmol·L-1时，其起始侧根原基数显著减少；而辽春10号的幼苗只有在5 nmol·L-1BL处理时起始侧根原基数显著增加，当BR浓度上升至100 nmol·L-1时，开始出现抑制；用BRZ处理时，两个品种基本无明显变化。两个品种的测定结果表明 BL作用于侧根原基起始过程，可以增加起始侧根原基数目，而且辽春10号比中国春对BL更加敏感。虽然起始原基数目显著增加，但是考虑到侧根原基突破主根表皮之后才算是侧根，所以本研究对整个主根进行侧根原基长出率的统计和计算(图 5C和图5D)。经过BL处理后小麦幼苗的侧根原基长出比例会显著提高，说明适宜浓度BL会促进小麦侧根原基的形成，加快侧根原基突破主根皮层的速度，从而使侧根数目增加。

图3 不同浓度 BL 和 BRZ 处理对小麦幼苗根系直径的影响Fig.3 Effects of different concentrations of BL and BRZ on root diameter of wheat seedlings

3 讨 论

植物根系是获得养分的关键，根系的形态调整是植物适应环境的重要策略，对于农业生产意义重大。小麦是典型的须根系植物，没有主根，根系由初生根和次生根以及其上着生的各级侧根构成，侧根分枝可以达到6级，是小麦根系的主要组成部分[23]。根长及侧根的分布对于确定根系统结构至关重要，直接关系到根系对不同土层水分与养分的吸收。近年来，单子叶植物相应研究也陆续开展，尤其是水稻根系的相关研究，并取得了一定的进展，但目前有关BR对小麦根系的研究还鲜有报道[24-25]。

本研究发现，BRs对小麦幼苗地上部分的影响不明显，但对根系生长发育却具有明显效应，这可能与该研究采用水培实验方法相关。此外，BRs对小麦种苗根系效应呈现明显的浓度梯度，即低浓度促进，高浓度抑制。本研究中，促进根长生长的最适浓度为5 nmol·L-1，超过该浓度时，根长的抑制现象逐渐严重；低于此浓度时，对小麦根长有促进效应，但同时会造成根系形态异常，这均与前人的研究结果基本一致[26-27]。

本研究首次报道了BRs对小麦根系直径具有显著效应，并通过切片技术进行了细胞学分析，这在其他植物研究中均未有相应的报道，其是否为小麦等禾本科特有的调控，或是外源BL处理带来的表型，仍需要进一步的证实。本研究结果表明，BRs对于小麦幼苗侧根数目也表现出低促高抑的现象，适宜浓度处理下(中国春为100 nmol·L-1, 辽春10号为5 nmol·L-1)，幼苗侧根数目均极显著的增加，但不同小麦品种对BR的敏感性明显不同，因此其对应的最适浓度也存在差异；当浓度高于1 μmol·L-1时，BRs则对小麦侧根数目产生抑制作用，与Gupta之前在拟南芥上的研究结果相近[28]。此外，在适宜浓度的BRs处理下，除了起始侧根原基的数目增加，小麦侧根原基生长速率也显著提高，这和本实验室前期在拟南芥上的研究结果一致，说明BRs可能通过正向调控一种丝氨酸羧肽酶BRS1使植物侧根原基更容易突破根皮层，使侧根原基生长速率增快，从而使植物的侧根数目显著增加[29]。

图4 不同浓度 BL 和 BRZ 处理对小麦幼苗根数目的影响Fig.4 Effects of different concentrations of BL and BRZ on root number of wheat seedlings

根据两种小麦品种的对比可知，不同小麦品种响应BR信号途径和强弱可能有所差异，具有遗传多样性。外源施用BRs时，对于不同的品种可能需要考虑不同的最优处理浓度。此外，虽然实验室结果表明油菜素内酯可用于小麦幼苗根系生长的调节，但其对于大田小麦的作用效果和具体作用机制，还有待于进一步研究。

图5 不同浓度 BL 和 BRZ 处理对小麦幼苗侧根发育的影响Fig.5 Effects of different concentrations of BL and BRZ on lateral roots development of wheat seedlings