小麦钾离子通道蛋白基因 TaAKT1的功能分析

毕惠惠，毛伟伟，李海霞，程西永，周渭皓，周思远，武会芳，许海霞

(河南农业大学/省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室,河南郑州 450046)

小麦是世界上重要的粮食作物之一，约40%的人口以小麦为主粮[1]。我国耕地普遍存在缺钾现象[2]，缺钾会引起小麦的产量下降，品质劣化，耐逆性减弱，严重威胁我国粮食安全[3-5]。钾离子通道蛋白在植物吸收外界钾离子过程中发挥重要作用，植物中的钾离子通道蛋白主要包括两类：非电压门控通道蛋白和电压门控通道蛋白[6]。非电压门控通道蛋白的活性不受膜两侧电势差控制，其大部分成员可以与钙离子结合，活性直接受钙离子调控[7-8]。电压门控通道又称Shaker-type通道，其蛋白活性受膜两侧电势差控制[9]。植物的Shaker-type通道蛋白在序列和结构上相似性较高，而且和动物的Shaker通道蛋白也有一定的相似性[10]。Shaker-type通道蛋白由四个亚基组成，每个亚基包含6个跨膜区域，第2个跨膜区域为电压感受器；第5、6跨膜结构域之间形成环状结构，具有保守序列TxxTxGYGD，能选择性结合钾离子[11-12]。最早被克隆的植物Shaker-type通道蛋白是拟南芥AtAKT1，属于内流钾离子通道蛋白[13]。Hirsch等[14]研究发现，拟南芥AtAKT1可以介导拟南芥对土壤中的钾离子吸收。Xu等[15]研究发现，Atakt1基因突变体的钾离子吸收效率显著下降，在低钾胁迫条件下，突变体的长势明显劣于野生型，且表现出叶片黄化等缺钾病症；进一步研究发现AtCIPK23 可以使 AtAKT1 磷酸化，激活 AtAKT1 的钾离子吸收功能。此外，研究表明，在低钾条件下，拟南芥Atakt1突变体的主根较野生型的长，是由于野生型拟南芥生长素积累的减少导致的[16]。龙 雨[17]的研究表明，水稻OsAKT1基因主要在根的表皮和维管组织中表达，Osakt1基因突变体表现出明显的低钾敏感表型；并在爪蟾卵母细胞中验证了OsAKT1的钾离子吸收活性受上游OsCBL1-OsCIPK23的调控。李 娟[18]在钾缺陷型酵母中验证了OsAKT1具有钾离子转运活性。以上研究结果说明，AKT1具有转运钾离子的功能，并且其功能受CIPK23调控而增强；并且AKT1基因与植物的生长发育具有密切的关系。

钾离子通道蛋白在植物钾离子吸收过程中起着重要作用，但是目前对小麦钾离子通道蛋白的功能研究较少，尤其是小麦TaAKT1的钾离子转运功能及相关的调控模式未见报道。本研究通过克隆小麦TaAKT1基因，研究其在低钾胁迫条件下的表达情况及在小麦中的表达特异性，利用酵母突变体鉴定TaAKT1基因的功能以及TaCIPK23基因对TaAKT1基因的调控作用，以期为小麦钾离子调控机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料及处理

以普通小麦(TriticumaestivumL.)品种石4185为试验材料，对其种子表面进行灭菌处理：70%酒精浸泡4 min，无菌蒸馏水洗涤3次。将种子置于发芽盒内，室温条件下培养2 d，使其发芽。将长势一致的种子移入1/2 Hoagland营养液中，在光照培养箱内培养；设定培养箱参数为：温度23 ℃，光暗周期16/8 h，光子通量密度250 μmol·m-2·s-1。当小麦幼苗生长到两叶一心时，将幼苗移入钾离子浓度为50 μmol·L-1的1/2 Hoagland营养液中，分别在处理0、6、12、24和48 h后，采集植株的根与叶。收集材料时，用无菌蒸馏水充分冲洗，用滤纸吸干水分，立即放入液氮中速冻，置于-80 ℃冰箱中保存备用，以上各样品均进行三个生物学重复。

1.1.2 菌株及载体

大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、WΔ3菌株为本实验室保存。酿酒酵母菌株WΔ3(MATα, ade2, ura3, trp1, trk1Δ::LEU2, trk2Δ::HIS3)缺失了高亲和钾离子吸收载体TRK1与TRK2，在低于10 mmol·L-1KCl的AP培养基上生长受阻，WΔ3为营养缺失型突变体菌株，不能合成腺嘌呤(Adenine)、尿嘧啶(Uracil)和色氨酸(Trp)。克隆载体pMD19-T购自宝日医生物技术(北京)有限公司。pYPGE15和p414酵母高效表达载体为本实验室保存，其中pYPGE15可以编码磷酸甘油酸激酶(PGK1)启动子、氨苄青霉素(Amp)和尿嘧啶(Uracil)基因；p414可以编码Trp基因。

1.1.3 主要试剂

DNA聚合酶KOD Plus Neo购于东洋纺(上海)生物科技有限公司，l kb DNA Ladder和dNTP购自天根生化科技(北京)有限公司，小量质粒提取试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司，DNA限制性内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，Trizol提取液购于上海英骏生物技术有限公司，T4连接酶和荧光定量试剂GoTaq○RqPCR Master Mix购于普洛麦格(北京)生物技术有限公司，氨苄青霉素、胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒均购于生工生物工程(上海)股份有限公司，感受态细胞制备试剂盒、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)均购于宝日医生物技术(北京)有限公司。试验中使用的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列分析由生工生物工程(武汉)股份有限公司进行。其它试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 总RNA的提取及cDNA的合成

采用Trizol法提取小麦总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并用超微量紫外可见分光光度计(NanoDrop 2000C，Thermo-Fisher)检测RNA的浓度和质量。利用cDNA合成试剂盒，按照说明书进行cDNA合成。

1.3 TaAKT1基因的克隆

根据小麦TaAKT1(GenBank登录号AF207745.1)序列信息，利用Primer Premier 5.0软件设计引物(表1)，使用KOD Plus Neo聚合酶克隆TaAKT1基因。PCR体系与程序参考说明书，其中循环数为30，退火温度为68 ℃，延伸时间为3 min。将扩增产物胶回收，并进行+A处理，产物纯化后连接pMD19-T载体，将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性单克隆，测序鉴定。测序正确的菌株扩大培养，提取质粒DNA，-20 ℃保存。

1.4 TaAKT1蛋白的生物信息学分析

利用ExPASy-ProtParam-(http://web.expasy.org/protparam/)预测TaAKT1蛋白的理化性质；利用CBS-TMHMM 2.0 Server /(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)进行氨基酸序列的跨膜区分析；利用ExPASy-PROSITE(http://prosite.expasy.org/)预测TaAKT1蛋白的结构域；从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下载植物钾离子通道蛋白序列，由DNAMAN 5.0软件完成多序列比对，并利用MEGA 6.0绘制系统进化树。

1.5 TaAKT1基因表达模式分析

根据小麦β-Actin、TaAKT1基因序列，利用Primer Premier 5.0软件，设计qRT-PCR引物(表1)，使用GoTaq○RqPCR Master Mix，在BIO-RAD CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行扩增，反应体系与程序参照试剂盒说明书，其中循环数为40，退火温度为58 ℃。每个样品重复3次，均做3个平行管。利用公式2-ΔΔCt计算相对表达量，分析TaAKT1基因表达的组织特异性及低钾胁迫条件下的表达模式。

1.6 酵母表达载体构建及TaAKT1基因功能互补实验

以含有目的基因的质粒DNA为模板，设计特异性引物(表1)，扩增含XbaⅠ与SalⅠ酶切位点的TaAKT1基因开放阅读框序列。用XbaⅠ与SalⅠ酶切TaAKT1基因扩增产物，进行胶回收，将扩增产物连入pYPGE15载体的相应酶切位点，构建酵母表达载体pYPGE15-TaAKT1。对pYPGE15-TaAKT1进行双酶切验证，并测序。

用PEG热激法[19]，将空载体pYPGE15和pYPGE15-TaAKT1分别转入酵母突变体菌株WΔ3中。pYPGE15载体上含有编码尿嘧啶(U)的序列，而酵母菌株WΔ3不含有编码U的序列，因此用不含U的YNB培养基筛选阳性转基因酵母菌落。得到阳性酵母菌株后用液体YNB培养基过夜培养至饱和，每个样本菌液吸取1 mL至新的1.5 mL无菌离心管中，5 000 r·min-1离心1 min；弃上清，用无菌水洗涤两次后，重悬菌体，调整菌液浓度至OD600为0.8左右；配制KCl浓度分别为100 mmol·L-1(对照)、5 mmol·L-1和60 μmol·L-1的AP固体培养基。将菌液分别稀释10、100和1000倍，在每个梯度稀释液中吸取5 μL菌液，点在含有不同K+浓度的AP固体培养基上，30 ℃倒置培养3 d，菌斑清晰可见时照相保存。

1.7 TaCIPK23对TaAKT1的调控实验

从小麦中克隆TaCIPK23基因(GenBank登录号JX243012.1)，构建酵母表达载体p414-TaCIPK23，构建方法与载体pYPGE15-TaAKT1类似。用PEG热激法[19]将pYPGE15、pYPGE15-TaAKT1、p414-TaCIPK23分别转入酵母菌株WΔ3中，酵母互补表型实验方法同上。配制KCl浓度分别为100 mmol·L-1(对照)、1 mmol·L-1、60 μmol·L-1的AP培养基，取上述饱和菌液的稀释液点样于AP培养基上，3 d后照相保存。

表1 实验所用引物Table 1 Primers used in this study

下划线部分为酶切位点。

The underlined sequences indicate the sites of restriction enzymes.

2 结果与分析

2.1 TaAKT1基因的克隆和序列分析

根据TaAKT1基因的cDNA序列设计特异性引物，以普通小麦品种石4185的cDNA为模板，RT-PCR扩增得到一个2 800 bp左右的条带，与预期片段大小一致(图1)。将扩增片段胶回收后，连接pMD19-T载体，送至生工生物工程(武汉)股份有限公司测序，测序结果与目的序列一致。

M：1 kb ladder；1：TaAKT1扩增产物。

M: 1 kb ladder; 1: PCR product ofTaAKT1.

图1TaAKT1基因的扩增产物

Fig.1PCRamplificationofTaAKT1

利用ProtParam预测TaAKT1蛋白的基本特征，结果显示TaAKT1包含897个氨基酸，相对分子质量为100.92 kDa，等电点为7.63，不稳定系数为42.45，属于稳定蛋白；利用TMHMM 2.0 Server 进行跨膜结构预测，结果表明TaAKT1包含5个跨膜结构域，C末端较长，从第311个氨基酸到第897个氨基酸，均为亲水性氨基酸序列。利用 PROSITE预测TaAKT1蛋白的结构域，发现TaAKT1的CNBD(环核苷酸结合结构域)位于第391～497氨基酸位点之间，锚定重复序列结构域位于第545～723氨基酸位点之间，KHA(富含疏水和酸性氨基酸)结构域位于819～897氨基酸位点之间(图2)。

利用MEGA 6.0软件根据邻接法(neighbor-joining, NJ)绘制系统进化树，结果显示，小麦TaAKT1与Shaker-type通道蛋白成员大麦、粗山羊草、二穗短柄草和水稻的AKT1亲缘关系较近，而与非电压门控通道蛋白水稻OsKCO1和大麦HvKCO1关系较远(图3)。多序列比对结果显示，TaAKT1蛋白与大麦HvAKT1、二穗短柄草BdAKT1、玉米ZmAKT1、水稻OsAKT1和拟南芥AtAKT1同源性分别为97.22%、86.50%、79.16%、76.03%和60.55%，而且它们都具有钾离子通道蛋白的特征序列TxxTxGYGD(图4)。

2.2 TaAKT1基因的表达模式

利用qRT-PCR对TaAKT1基因的组织表达特异性进行了分析，结果显示，TaAKT1在小麦根部的相对表达量较高(1.00)，约为叶部相对表达量(0.21)的5倍。

利用qRT-PCR对TaAKT1基因响应钾离子饥饿进行了分析，结果表明，在低钾环境下小麦根部TaAKT1的表达量基本呈现先升高，后下降的趋势；低钾处理6 h后，TaAKT1的表达量最高，约为初始表达量的5倍；12 h后，表达量急剧下降，但仍高于初始表达水平；第24 h和48 h的表达量接近初始表达水平(图5A)。而叶部TaAKT1的表达量无明显差异(图5B)。

图2 TaAKT1蛋白的结构域预测Fig.2 Domain prediction of TaAKT1

Aet：Aegilopstauschiisubsp.Tauschii; Ta:Triticumaestivum; Hv:Hordeumvulgare; Bd:Brachypodiumdistachyon; Os:Oryzasativa; At:Arabidopsisthaliana; Zm:Zeamays.

图3TaAKT1蛋白系统进化分析

Fig.3PhylogenicrelationshipofTaAKT1andotherpotassiumchannelproteins

A:TaAKT1(Triticumaestivum, GenBank: AAF36832.1); B:HvAKT1 (Hordeumvulgare, GenBank: ABE99810.1); C:BdAKT1 (Brachypodiumdistachyon, GenBank: XP_003569453.1); D:OsAKT1 (Oryzasativa, GenBank: P0C550.1); E:ZmAKT1 (Zeamays, GenBank: XP_008675279.1); F:AtAKT1 (Arabidopsisthaliana, GenBank: NP_180233.1).加框部分为钾离子通道的特征序列TxxTxGYGD(The potassium ion channel characteristic sequence is in box).

图4AKT1蛋白多序列比对

Fig.4MultiplesequencealignmentofAKT1protein

图5 低钾环境下小麦根部(A)和叶部(B)TaAKT1基因的相对表达量Fig.5 Expression level of TaAKT1 gene in root (A) and leaf (B) under low-potassium conditions

2.3 TaAKT1基因的表达载体及钾离子转运功能

构建酵母表达载体 pYPGE15-TaAKT1，将表达载体进行双酶切和测序鉴定，显示载体构建正确(图6)。利用PEG热激法将pYPGE15和pYPGE15-TaAKT1分别转入酵母突变体菌株WΔ3，利用营养缺失法筛选出阳性转基因酵母。

酵母功能互补实验结果显示，在含100 mmol·L-1KCl的AP培养基中，转TaAKT1基因与转空载体pYPGE15的酵母长势一致(图7)。在含5 mmol·L-1KCl的AP培养基中，转空载体酵母长势明显受到抑制，而转TaAKT1基因酵母菌株生长几乎不受影响。当AP培养基中KCl浓度降至60 μmol·L-1时，转TaAKT1基因的酵母与转空载体的酵母都不能生长。说明TaAKT1基因能部分恢复WΔ3菌株的钾离子吸收能力。

1：pYPGE15-TaAKT1质粒；2：pYPGE15-TaAKT1双酶切；M：1 kb ladder。

1: pYPGE15-TaAKT1 plasmid; 2: Digested products of pYPGE15-TaAKT1 with restriction enzymes; M: 1 kb ladder.

图6pYPGE15-TaAKT1的双酶切检测

Fig.6IdentificationofpYPGE15-TaAKT1digestedwithrestrictionenzymes

A：转pYPGE15的酵母；B、C：转pYPGE15-TaAKT1的酵母。

A:WΔ3transformed with pYPGE15; B, C:WΔ3transformed with pYPGE15-TaAKT1.

图7转TaAKT1基因的酵母表型验证

Fig.7PhenotypicidentificationofWΔ3transformedwithTaAKT1

2.4 TaCIPK23对TaAKT1的调控作用

为了探究TaAKT1基因的调控途径，构建了酵母表达载体p414-TaCIPK23。双酶切(图8)和测序结果显示，载体构建正确。将p414-TaCIPK23和pYPGE15-TaAKT1共同转入酵母突变体菌株WΔ3，用含100 mmol·L-1KCl的AP培养基为对照，观察转基因酵母分别在含100 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1KCl和60 μmol·L-1KCl的AP培养基上的表型。在含100 mmol·L-1KCl的AP培养基上，转空载体pYPGE15、转TaAKT1基因、转TaCIPK23+TaAKT1基因的三种菌株长势一致(图9)，随着AP培养基中K+浓度降低，菌株的生长受到抑制。当AP培养基中KCl浓度降为1 mmol·L-1时，转空载体的酵母菌株受影响最大，不能生长；而转TaAKT1的酵母突变体菌株生长严重受抑制；转TaCIPK23+TaAKT1的菌株受影响较小；在含60 μmol·L-1KCl的AP培养基上，转空载体与转TaAKT1基因的酵母菌株均不能生长，转TaCIPK23+TaAKT1基因菌株可以生长。前期的实验证明单独的TaCIPK23不具备钾离子吸收能力，因此，推测 TaCIPK23具有促进TaAKT1钾离子吸收的作用。

M：1 kb ladder；1和2：p414-TaCIPK23的双酶切结果。

M: 1 kb ladder; 1 and 2:Digestion of p414-TaCIPK23by restriction enzymes.

图8p414-TaCIPK23的双酶切验证

Fig.8Identificationofp414-TaCIPK23digestedwithrestrictionenzymes

A：转pYPGE15的酵母；B：转pYPGE15-TaAKT1的酵母；C：转pYPGE15-TaAKT1和p414-TaCIPK23的酵母。

A:WΔ3transformed with pYPGE15; B:WΔ3transformed with pYPGE15-TaAKT1; C:WΔ3transformed with both pYPGE15-TaAKT1 and p414-TaCIPK23.

图9TaCIPK23、TaAKT1共表达酵母表型

Fig.9PhenotypicidentificationofWΔ3transformedwithbothTaAKT1andTaCIPK23

3 讨 论

近年来，随着我国粮食产量和复种指数的提高，土壤中钾离子含量在不断下降[2]，缺钾使小麦的产量降低，品质下降，严重制约我国粮食生产[3-5]。培育钾高效利用小麦品种，是解决上述问题的有效途径。从分子角度研究小麦的钾离子吸收机制，可以为钾高效利用小麦的培育提供理论依据。本研究利用qRT-PCR分析发现，小麦钾离子通道蛋白基因TaAKT1响应低钾胁迫，酵母功能互补结果表明TaAKT1具有转运钾离子的功能，TaCIPK23可能具有增强TaAKT1吸收钾的作用。对TaAKT1基因功能的初步分析为小麦钾离子通路的研究奠定了基础。生物信息学分析是蛋白结构及功能预测的有效手段[20]，利用此方法，我们发现小麦TaAKT1蛋白与大麦HvAKT1、粗山羊草AetAKT1、二穗短柄草BdAKT1、水稻OsAKT1和拟南芥AtAKT1具有较高同源性。HvAKT1[21]和AtAKT1[22]都被证实具有介导钾离子吸收能力，因此预测TaAKT1可能为钾离子转运蛋白。利用PROSITE对TaAKT1进行结构域分析，结果显示TaAKT1具有CNBD(环核苷酸结合域)、锚定重复序列结构域和KHA(富含疏水和酸性氨基酸残基)结构域，符合Shaker-type通道蛋白的基本特征[11]。有活性的Shaker-type通道蛋白都是由四个亚基组成的，环核苷酸结合区域和KHA区域可能在亚基的聚合过程中发挥重要作用[23]。锚定重复序列结构的存在说明该蛋白可与其他蛋白互作，活性可受到其它蛋白的调节。Véry和 Sentenac[11]指出，Shaker-type 通道蛋白亚基由6个跨膜区域组成，本研究利用TMHMM 2.0 Server软件对植物的Shaker-type的AKT1亚家族进行了跨膜结构预测，发现大部分AKT1都包含5个跨膜结构，如小麦TaAKT1、水稻OsAKT1、拟南芥AtAKT1和二穗短柄草BdAKT1等，可能是第三跨膜区域较短的缘故。

对TaAKT1基因的表达模式研究表明，正常条件下，小麦TaAKT1基因主要在根部表达，其表达量是叶部的5倍，说明TaAKT1基因的表达具有组织特异性，这一结果与大麦HvAKT1基因相似[21]。低钾使小麦根部的TaAKT1基因上调表达，而对叶部TaAKT1基因的表达量无显著影响。可能是由于根是直接介导钾离子吸收的器官，最先与钾离子接触，因此易受缺钾影响。Pilot[22]等通过实验证明拟南芥根部和叶部的AtAKT1基因表达都不受低钾诱导，而本研究发现小麦根部TaAKT1基因表达受低钾诱导，说明小麦TaAKT1基因与拟南芥AtAKT1基因表达模式不同。

酵母是最早完成测序的真核生物，由于其具有遗传背景简单、易于进行遗传转化、培养周期短、易获得突变体等特点，现已广泛应用于外源基因功能的研究。目前，人们对酵母离子转运机理研究的较为透彻，已通过基因工程技术，获得了许多离子转运功能缺失突变体，这些突变体为植物Na+、K+转运蛋白的鉴定提供了便利[24]。本研究利用酵母功能互补实验发现TaAKT1能介导钾离子吸收，可以部分恢复酵母突变体WΔ3的高亲和钾离子吸收能力，但这种恢复能力有限。进一步研究发现，TaCIPK23具有调控TaAKT1的作用，在低钾环境下，可以增强TaAKT1介导钾离子吸收的能力。这与其他植物有关AKT1功能的报道是一致的。在拟南芥中AtAKT1受到AtCBL1/AtCIPK23或AtCBL9/AtCIPK23复合体激活能增强对钾的吸收[15]。Boscari[21]通过在非洲爪蟾卵母细胞中进行异源表达实验，发现AtCBL1或AtCBL9与AtCIPK23同时存在的条件下可以激活大麦的HvAKT1的钾离子通道蛋白活性。而本研究发现单独的TaCIPK23可以增强小麦TaAKT1的钾离子吸收活性，但是，在TaCBLs的存在下，这种钾离子转运能力能否进一步增强，小麦中CBLs和CIPK23互作对TaAKT1的调控等，都需要进一步研究。