吉林人参低聚肽对小鼠耐缺氧作用的研究

任金威，李 迪，孙靖琴，刘欣然，张召锋，王军波，李 勇

(北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，北京 100191)

当机体缺氧时，不仅会影响机体内神经、消化、呼吸、泌尿、内分泌等各个系统的生理功能，还会影响机体内碳水化合物、蛋白质、脂类、水和电解质等各种物质的代谢过程，严重危害生物体的健康[1-3]。其具体症状一般包括心跳加快、口干，进一步可出现恶心、呕吐、腹泻、心悸、呼吸短促，更甚者出现全身乏力、昏迷、休克等[3-4]。因此，寻求安全有效的防治缺氧的措施，以减少缺氧及相关疾病的发生，具有重要的科学价值和社会意义。在很长的一段时期内，国内外关于耐缺氧的研究主要集中在寻找预防和治疗缺氧的药物上。近年来，学者们的研究目光开始转向食品领域，已有大量研究证实，天然食物成分在改善缺氧方面是安全有效的。

生物活性肽(BAP)是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物[5]。研究发现，机体对低聚肽的吸收和代谢速度比对游离氨基酸快[6]。另外，BAP类具有广泛的生物活性，如免疫调节、抗高血压、降胆固醇、抗氧化和清除自由基作用等。目前BAP以其高效、安全的特点异军突起，逐渐显示出其在临床营养中的重要作用和广泛的应用前景[5]。

2012年9月4日，中国卫生部批准人参成为新资源食品，人参的应用将由单一的中药材拓展到食品、饮料及保健产品等领域，范围大幅扩大，这为我国的人参产业发展提供了新的契机[7]。研究发现，人参具有显著的耐缺氧作用[8-9]。对人参提取物人参皂苷的研究也表明，人参皂苷rgl[10]、Rb1[11-12]等均有改善缺氧耐受力的作用。

人参低聚肽虽然作为一类重要的化合物存在于人参组织中，但其功能研究较少报道。低聚肽在人体内不需消化可直接吸收，比单个氨基酸吸收更有效，可直接参与蛋白质的合成[5]，可避免活性物质的浪费，大大提高其生理调节作用。本实验通过常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒存活实验和急性脑缺血性缺氧实验，观察吉林人参低聚肽(ginseng oligopeptides，GOP)水溶液的耐缺氧效果，为缺氧的营养干预和GOP功能性食品开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

健康SPF级成年雄性BALB/C小鼠180只，适应期结束时，体重18～22 g，由北京大学医学部实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(京)2011-0012。分笼饲养，每笼5只，自由饮食、饮水。动物饲养实验室符合国标清洁级，温度范围为22±2℃，相对湿度为50%～60%，昼∶ 夜明暗交替时间为12h∶ 12h。

GOP，淡黄色固体粉末，利用生物酶解技术从吉林人参中分离得到的小分子生物活性肽的混合物，混合物主要以小分子低聚肽为主，分子量小于1 000，质量分数为95.42%，吉林肽谷生物工程有限责任公司；钠石灰，AR，成都金山化学试剂有限公司；亚硝酸钠，AR，重庆百倍精细化工厂；凡士林。

1.2 仪器与设备

AdventurerTM通用型分析天平，美国奥豪斯国际贸易有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1常压耐缺氧实验 取60只BALB/C小鼠，按体重随机分成6组，每组10只。实验设立4个GOP剂量组[0.075、0.150、0.300、0.600g/(kg·BW)]、1个空白对照组和1个乳清蛋白组[0.300g/(kg·BW)]。分组后，4个剂量组每天灌胃给予不同浓度的GOP水溶液，空白对照组每日灌胃给予同体积的蒸馏水，乳清蛋白组给予同体积乳清蛋白水溶液。灌胃量为1mL/100g，每日1次。乳清蛋白水溶液和GOP水溶液均用蒸馏水配制。所有的动物每周均称量体重1次，按体重水平调整灌胃量，实验结束时最后1次称重。每日观察小鼠的食欲行为、状态、毛发及动物死亡情况。连续灌胃干预30d。在动物末次灌胃后1h，将各组动物放入250mL磨口瓶内(瓶内盛有5g钠石灰)，每瓶1只，用凡士林密封瓶口，保证不漏气。立即计时，记录小鼠因缺氧而停止呼吸的时间。

1.3.2亚硝酸钠中毒存活实验 动物分组及干预方法同1.3.1，在动物末次灌胃后1h，各组动物腹腔注射亚硝酸钠溶液，注射剂量为240mg/(kg·BW)，注射量为0.1mL/10g。立即计时，记录小鼠存活时间。

1.3.3急性脑缺血性缺氧实验 动物分组及干预方法同1.3.1，在动物末次灌胃后1h，各组小鼠逐只自颈部断头，立即按下秒表，记录动物自断头后至张口喘气停止的时间。

1.4 统计方法

2 结果与分析

2.1 GOP对小鼠常压缺氧存活时间的影响

实验结束时，与空白对照组比较，乳清蛋白组及人参肽A、B、C、D剂量组常压耐缺氧存活时间均显著延长，延长率分别为8.8%、24.5%、41.5%、47.3%和53.8%，上述差异均具有统计学意义(P<0.05)。与乳清蛋白组比较，人参肽A、B、C、D剂量组小鼠常压耐缺氧存活时间均显著延长，差异均具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1人参肽对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响

组别动物数(只)剂量[g/(kg·BW)]存活时间(min)延长率(%)空白对照组10036.67±3.86—乳清蛋白组100.15039.91±3.998.8人参肽A剂量组100.07545.66±3.49ab24.5人参肽B剂量组100.15051.89±3.06ab41.5人参肽C剂量组100.30054.03±4.05ab47.3人参肽D剂量组100.60056.42±8.23ab53.8

注：a与空白对照组比较差异有显著性(P<0.05)；b与乳清蛋白组比较差异有显著性(P<0.05)

2.2 GOP对小鼠亚硝酸钠中毒所致缺氧存活时间的影响

实验结束时，与空白对照组相比，人参肽B、C、D剂量组存活时间显著延长，延长率分别为23.6%、41.4%、45.9%，差异具有统计学意义(P<0.05)。与乳清蛋白组比较，人参肽C、D剂量组存活时间均显著延长，上述差异均具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2人参肽对小鼠亚硝酸钠中毒所致缺氧存活时间的影响

组别动物数(只)剂量[g/(kg·BW)]存活时间(min)延长率(%)空白对照组10018.56±1.37—乳清蛋白组100.15021.44±2.3215.5人参肽A剂量组100.07521.46±1.2915.6人参肽B剂量组100.15022.94±5.19a23.6人参肽C剂量组100.30026.25±4.92ab41.4人参肽D剂量组100.60027.08±5.73ab45.9

注：a与空白对照组比较差异有显著性(P<0.05)；b与乳清蛋白组比较差异有显著性(P<0.05)

2.3 GOP对小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间的影响

实验结束时，与空白对照组相比，人参肽A、B、C、D剂量组存活时间显著延长，延长率分别为4.5%、11.0%、11.0%和9.0%，差异具有统计学意义(P<0.05)。与乳清蛋白组比较，人参肽B、C、D剂量组存活时间显著延长，差异均具有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3人参肽对小鼠急性脑缺血性缺氧存活时间的影响

组别动物数(只)剂量[g/(kg·BW)]存活时间(min)延长率(%)空白对照组10020.00±0.67—乳清蛋白组100.15020.10±0.880.5人参肽A剂量组100.07520.90±0.88a4.5人参肽B剂量组100.15022.20±0.92ab11.0人参肽C剂量组100.30022.20±1.48ab11.0人参肽D剂量组100.60021.80±0.92ab9.0

注：a与空白对照组比较差异有显著性(P<0.05)；b与乳清蛋白组比较差异有显著性(P<0.05)

3 讨论

氧是维持正常生命活动所必需的物质。缺氧是临床上常见的病理过程，是导致病人死亡的重要原因之一[13]。一般来说，轻度缺氧主要引起机体的代偿反应，而严重缺氧则可导致组织细胞发生严重损伤和中枢神经系统、外呼吸和循环等主要系统功能障碍甚而功能衰竭[14]。因此，寻找有效的耐缺氧药物，减少缺氧的危害，对人类的健康有着十分重要的意义。

单纯的蛋白质摄入增加可能会对耐缺氧功能有一定的影响，乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀分离时保留在上清液中的多种蛋白质组分的统称，其在消化过程中产生多种生物活性多肽，具有提高免疫力、抗疲劳、抗氧化、耐缺氧等多种功效[15]。因此，为了排除因单纯增加蛋白质的摄入而引起的假阳性结果，本研究另设了乳清蛋白组作为对照组。本研究显示，实验结束时，与空白对照组和乳清蛋白组相比，GOP均可明显延长小鼠常压耐缺氧存活时间、亚硝酸钠所致缺氧存活时间和急性脑缺血性缺氧存活时间。

常压密闭环境下，由于供氧不足，导致动脉血氧含量减少，从而导致细胞内氧分压严重降低，致使线粒体用氧障碍而影响机体能量代谢。本研究显示，与空白对照组相比，人参肽各剂量组常压耐缺氧存活时间分别延长了24.5%、41.5%、47.3%和53.8%，乳清蛋白组延长了8.8%，说明人参肽可提高小鼠常压耐缺氧功能，且效果优于乳清蛋白。这可能与人参肽能够提高小鼠血氧饱和度和减少机体耗氧量有关。

亚硝酸钠中毒是由于亚硝酸钠使正常二价铁血红蛋白转变为三价铁血红蛋白，破坏血红蛋白携氧能力，造成组织缺氧死亡[16]。本研究显示，人参肽B、C、D剂量组亚硝酸钠中毒存活时间较空白对照组分别延长了23.6%、41.4%和45.9%，而乳清蛋白组存活时间无显著增长，提示人参肽可改善小鼠亚硝酸钠中毒导致的缺氧状况，而乳清蛋白暂未显示此作用。推测人参肽可能通过缓解小鼠细胞外液的缺氧状况，提高小鼠细胞对氧的利用效率，增加血红蛋白的含量，从而延长小鼠缺氧的存活时间。另一方面，该作用也可能与人参肽具有抗氧化作用有关，具体机制尚待进一步研究和探讨。

小鼠自颈部断头后，大脑虽供血终止，但脑中原有的营养物质和血液尚能够暂时维持大脑功能，从而使小鼠可以有规律地张口喘气。观察动物自断头后至张口喘气停止的时间，可以评价人参肽对急性脑缺血性缺氧的保护作用。本研究结果表明，实验结束时，与空白对照组比较，人参肽各剂量组急性脑缺血性缺氧存活时间分别延长了4.5%、11.0%、11.0%和9.0%，而乳清蛋白组存活时间延长不显著。提示人参肽可以缓解小鼠急性脑缺血性缺氧，而乳清蛋白无此作用。这可能与人参肽增强了神经细胞的耐缺氧能力有关。

本研究表明，实验结束时，与空白对照组比较，人参肽4个剂量组常压耐缺氧存活时间和急性脑缺血性缺氧存活时间均显著延长；除A剂量组外，其余各组亚硝酸钠中毒存活时间显著延长。与乳清蛋白组相比，人参肽4个剂量组常压耐缺氧存活时间均显著延长；C、D剂量组亚硝酸钠中毒存活时间显著延长；B、C、D剂量组急性脑缺血性缺氧存活时间显著延长。因此，本实验结果表明，GOP能延长小鼠常压耐缺氧存活时间、亚硝酸钠所致缺氧存活时间和急性脑缺血性缺氧存活时间。

4 结论

本研究通过常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒存活实验和急性脑缺血性缺氧实验，设立空白对照组和乳清蛋白组作为对照组，探讨GOP对小鼠耐缺氧作用的影响。结果提示，GOP能延长小鼠常压耐缺氧存活时间、亚硝酸钠所致缺氧存活时间和急性脑缺血性缺氧存活时间，表明GOP具有耐缺氧作用，具备作为一种新型耐缺氧制剂的潜力，有关其耐缺氧作用的深层机制尚有待进一步的研究与探讨。◇