小鼠肾小球分离方法比较及原代足细胞鉴定

方 际，吴鹤瑾，王 浩

足细胞在蛋白尿的发生发展中起重要作用[1]，但因其为高度分化的终末期细胞，其体外培养一直较为困难。国外已有实验室成功建立人、鼠条件永生化足细胞株[2,3]，但细胞株在生长、遗传特征及细胞结构等方面与原代细胞相差较大，不能很好地模拟相关的肾脏病理生理学状况，这使基于永生化足细胞株的实验结果的可信度大大降低。以前的文献主要集中在大鼠的原代足细胞培养，有关小鼠足细胞原代培养技术少见报道。本研究通过比较差异过筛法和免疫磁珠法，旨在明确小鼠肾脏足细胞原代培养的最佳模式。

1 材料与方法

1.1 实验材料 C57/BL6J小鼠，30 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。激光共聚焦显微镜购自Leica SP8公司，相差显微镜购自OLYMPUS公司，免疫磁珠购自Dynal公司，PCR 仪购自ABI公司。RPMI 1640培养液购自Cornning公司，Ⅳ型胶原酶、链酶蛋白酶E、脱氧核糖核酸酶Ⅰ均购自Sigma公司，胎牛血清购自Gibco公司，Podocin抗体购自Abcam公司，荧光二抗购自Cell Signaling Technology公司，逆转录试剂盒及Trizol购自Invitrogen公司，曲拉通 X-100及80、150、300目不锈钢筛网购自上海生工技术有限公司。

1.2 C57/BL6J小鼠肾小球分离

1.2.1 差异过筛法 小鼠腹腔注射2.5% 戊巴比妥(0.1 ml/30 g)，麻醉后，用75% 乙醇消毒皮肤，先后暴露腹腔、胸腔，行心脏灌注后迅速取出双侧肾脏，置于4 ℃ D-Hank’s 溶液中。去除包膜，分离肾皮质，用眼科剪将皮质剪成碎泥状。用注射器针芯轻轻研磨肾皮质，并不断用D-Hank’s 溶液冲洗。该冲洗液先过80 目不锈钢筛网，滤过的溶液再过150 目的不锈钢筛网，最后过300 目筛网。滞留在300 目筛网上即为肾小球初分离物，反复冲洗筛网后，收集分离物制成悬液，静置10 min 后，1000 r/min离心5 min，弃除上清，收集纯化的肾小球沉淀，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液制成肾小球悬液。

1.2.2 免疫磁珠法 常规动物麻醉、消毒皮肤，采用Liu等[4]方法从胸主动脉灌注，在肾脏建立局部循环。从胸主动脉先用37 ℃预热的PBS灌注10 ml(5 ml/min)，然后灌注37 ℃预热的总体积4 ml，包含有(胶原酶10 mg/ml+链酶蛋白酶E 10 mg/ml+脱氧核糖核酸Ⅰ 100 U/μl+免疫磁珠 200 μl)液体，灌注结束后迅速取出动物双侧肾脏，置于4 ℃ D-Hank’s 溶液中。去除包膜，分离肾皮质，用眼科剪将皮质剪成碎泥状。移入2 ml离心管，再加入上述消化酶1 ml，震荡孵育37 ℃，300 r/min，5 min。用移液枪轻柔吹打数次，过150目金属筛1次，借助磁力架洗涤、重悬，转入离心管中1000 r/min 离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液制成肾小球悬液。

1.3 肾小球形态学观察和计数 用10%胎牛血清的RPMI 1640培养液悬浮肾小球，倒置相差显微镜下观察其形态。经血球计数板计数不同分离方法得到的每只C57/BL6J小鼠的肾小球数目，同时计算无鲍曼囊肾小球占总肾小球的百分比，即为肾小球纯度。以2×104/孔的密度接种于六孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养。

1.4 免疫荧光鉴定 传代培养7 d，待细胞分化铺满瓶底后再行免疫荧光染色。步骤：足细胞以适当密度种植于24孔板上，37 ℃培养至细胞密度为60%～75%。4%多聚甲醛固定15 min，0.5%曲拉通 X-100穿孔15 min，1%牛血清白蛋白封闭30 min，分别加一抗Podocin(1∶1000)4 ℃过夜，然后加1∶500稀释的二抗室温反应1 h，然后加DAPI(1∶1000)3 min，上述每步操作后均用PBS漂洗。荧光显微镜下观察。

1.5 PCR法鉴定足细胞的标志蛋白 以永生化小鼠足细胞为阳性对照，小鼠肝细胞系为阴性对照。用Trizol 试剂提取足细胞总RNA，按照反转录试剂盒的操作步骤反转录合成cDNA，将产物进行PCR检测，反应体系参照试剂盒说明书，反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环，每样品做3个复管。

引物和内参序列如下：Podocin-F,5′-CACTCTTCAGTCGCTGTCCA-3′；Podocin-R, 5′-AGTTGATGCTCCCTTGTGCT-3′。GAPDH-F 5′-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3′；GAPDH-R, 5′-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3′。

2 结 果

2.1 肾小球的分离结果 差异过筛法获得肾小球纯度达(90.2±1.6)%，1只C57/BL6J小鼠可以得到(10 421±2421)个肾小球；视野中肾小球结构完整，可见肾小管碎片。免疫磁珠法获得的肾小球纯度达(96.7±1.2)%，1只C57/BL6J小鼠可以得到(16 112±2651)个肾小球；视野中肾小球结构完整，基本无肾小管。免疫磁珠法获得肾小球纯度和数目均高于差异过筛法，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 肾小球的培养及足细胞形态学特征 肾小球接种第3天可见80%以上肾小球贴壁，少量肾小球周围有多边形细胞爬出(图1A)，第7～10天所有贴壁肾小球周围都有大量细胞爬出(图1B)。消化传代后的足细胞继续生长，为多边形，无突起伸出，细胞迅速生长至融合状态，呈铺路石样外观(图1C)。第14天可呈完全分化状态，细胞体和细胞核较增殖状态显著增大，自细胞体伸出明显的树枝样突起，常见双核，相邻细胞间形成连接(图1D)。

图1 肾小球培养的原代足细胞

A.培养第3天(×200)；B.培养第7天(×200)；C.培养第14天(×100)；D.培养第14天(×400)

2.3 肾小球足细胞鉴定

2.3.1 免疫荧光染色鉴定 原代培养的足细胞均有Podocin蛋白染色，荧光闪亮，呈明显的亮绿色，在细胞浆内以丝状或线性沿细胞骨架分布，分布均匀，荧光染色细胞比例均为100%，证实了培养的细胞确为足细胞(图2)。

图2 原代足细胞Podocin蛋白免疫荧光染色(×200)

A.原代足细胞核DAPI染色；B.原代足细胞浆Podocin染色；C.原代足细胞merge图片

2.3.2 PCR法鉴定 原代足细胞和永生化小鼠足细胞均有Podocin基因表达，而阴性对照组未检测到该基因表达(图3)。

图3 PCR法检测小鼠肾脏足细胞中Podocin表达电泳图

1.原代培养小鼠足细胞；2.永生化小鼠足细胞系；3.肝细胞系

3 讨 论

近年来，慢性肾脏病已经成为全球性的公共卫生问题，而终末期肾脏病的发病率逐年增高[5]。在导致肾脏损害的病因中，足细胞作为肾小球滤过屏障的最后一道闸门，其损伤会导致蛋白尿的发生[6]，进而加重肾脏损害[7]。差异过筛法是最传统的分离肾小球的方法，Krakower等[8]最先报道了分离肾小球的方法，后来在大鼠[9]和兔[10]上也成功地分离了肾小球，在此基础上，Burlington等[11]改进了该方法，减少了金属筛对肾小球的损伤。但总体而言，差异过筛法的缺点是分离得到的肾小球纯度较低，往往混有肾小管碎片。

为了提高肾小球的纯度和数量，Takemoto等[12]首次采用免疫磁珠法分离小鼠肾小球，该方法缺点是费用昂贵。在此基础上，Zhao等[13]改进了实验方法，利用四氯化三铁代替免疫磁珠行体循环灌注，极大降低了实验成本，但是获得的肾小球有限。有别于常规的心脏灌注，Liu等[4]采用胸主动脉灌注，在肾脏建立局部循环，较心脏灌注的方法明显提高了免疫磁珠的使用效率。

本研究借鉴并比较了不同的肾小球分离技术，总结了做好小鼠原代足细胞的培养的一些经验：(1)分离肾小球建议使用免疫磁珠法，采用胸主动脉灌注，提高免疫磁珠的使用效率；(2)在消化肾脏皮质的时候，建议使用胶原酶，因为胶原酶比较温和，好掌握消化时间；(3)尽可能地提高肾小球的贴壁率，包括选择合适的筛网，动作轻柔，全程低温操作，在最短的时间内完成肾小球分离，使用胶原铺板的培养皿来种植肾小球，为减少对贴壁的干扰在前3 d避免换液；(4)利用内皮细胞和系膜细胞从肾小球内爬出时间和生长特性不同[14]，在培养10～12 d开始传代。本研究结果提示，免疫磁珠法较差异过筛法能更高效地分离出高纯度的小鼠肾小球。