固态发酵食醋中污染菌的控制研究综述

程 晔

（贵阳味莼园食品股份有限公司，贵州 惠水 550601）

引起固态发酵食醋产品在货架期间出现黏稠性沉淀物、产气、醋液呈不同程度的浑浊和发黏，严重的还会使产品产生恶臭的污染菌膜很难杀灭和根除。受这种杂菌污染的产品只要出现一批，就会使数批甚至数年，每年春末到初秋时段的醋产品受到影响。这种情况并非个例而是存在于绝大多数固态发酵食醋生产企业，危害极大。

对于引起食醋在货架期产气、浑浊、有异味等变质现象的研究已超过20年，参与研究的有工厂、高校、科研院所。研究中被企业广为采纳的结论是[1-3]：生醋应及时加热灭菌；最终醋产品的灭菌法采用高温一次灭菌法或二次灭菌法；加强生产过程的卫生管理，防止交叉污染。

目前研究中存在不足的是不能准确地解释食醋发酵生产中仅在夏季高温时节出现腐败现象；没有一个适用性强、准确、快速的检测方法及生产全过程的有效控制方法，食醋酿造行业内研究者难以从中获得一致性指导建议。

1 固态发酵食醋中菌膜的传统认知

肉眼观察到的固态发酵食醋中的膜状物，形态像醋蛾子或红茶菌膜的碎块。醋蛾子中最主要的成分是胶膜醋酸杆菌，也就是醋酸菌。红茶菌膜是多种醋酸菌、酵母菌和乳酸菌组成的“共生菌落”[4-5]。用醋蛾子酿醋法在民间由来已久，其中醋蛾子的主要成分是胶膜醋酸杆菌。胶膜醋酸杆菌又名膜醋酸菌、木醋酸菌，也是红茶菌中厚膜的主要成分。这种菌膜在酿制白醋工业中也有应用。

1.1 醋蛾子在表面发酵法酿制白醋生产中的应用

酿造食醋生产工艺分为固态发酵与液态发酵两大类，液态发酵酿醋工艺中又分为表面发酵法、淋浇发酵法、深层发酵法和固定化菌体连续发酵法。其中表面发酵法生产白醋[6]是在敞口容器中置醋种（上批的成熟醋），加入体积分数3%的酒液及少量营养物质，盖上缸盖，在自然气温或在30 ℃左右的保温室内自然发酵，此时醋酸菌在液面上形成一层菌膜。

日本最普遍采用的酿醋方法[7]按发酵形式可分为静置式和通气式两种。静置式酿醋法以米醋制法为例，米饭加曲糖化后进行酒精发酵，再加入醋酸菌、醋化杆菌等菌培养的醋母，在方形罐中静置发酵3～4 d，液面形成一层菌膜，开始生成醋酸。

1.2 酿造食醋的灭菌方法

食醋的pH值为2.8～3.8，属高酸食品，只要总酸≥3.5 g/100 mL，食醋中微生物80 ℃、10 min加热灭菌即可达到要求。即便是污染菌膜，鉴于对食醋中污染菌膜的传统认知，认为这种菌膜是醋酸菌、酵母菌和乳酸菌的共生菌，其致死温度和时间为50～65 ℃、10 min，食醋的常规灭菌温度和时间为80 ℃、10 min，是能达到GB 2719—2018《食醋卫生标准》和GB18187—2000《酿造食醋》中微生物指标要求的。

1.3 企业对固态醋酸发酵中污染菌膜的微生物检测方法

取变质醋样采用传统的增殖培养，将增殖培养的菌液用倾注法接种于不同的平板培养基中，进行厌氧或好氧培养，观察培养基上的菌落形态特征，再经染色法和显微镜法，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》[8]进行初步分类，分析判断污染细菌的种属，进而推断出该类菌的生长和致死条件。

产品出厂的食醋微生物检验均按照GB 4789.1—2016《食品微生物学检验总则》、GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》和GB/T4789.22—2003《食品微生物学检验调味品检验》微生物检验方法标准执行。

1.4 传统认知对食醋中污染菌膜的检验与控制的不适用性

（1）实践证明巴氏灭菌法不能杀灭食醋中污染菌膜。

（2）传统的微生物分离鉴定法不仅耗时长，而且在培养基上很难得到疑似单一菌株，也就无从进一步进行其生长特性及致死条件的试验。

（3）采用食品安全国家标准中的微生物检验方法，检验已变质的醋样，结果仍无法判断变质醋的微生物指标不合格。检验结果一般均符合GB 2719—2003《食醋卫生标准》和GB 18187—2000《酿造食醋》中微生物指标要求。其中菌落总数几乎都≤100 CFU/mL，远低于标准规定的≤10 000 CFU/mL。

2 固态发酵食醋中污染菌的研究

由于传统认知对食醋中污染菌的检验与控制方法的不适用性，食醋中引起黏度增加、产气、变质、拉丝、产膜的污染菌对酿醋行业的危害长期存在，一直是企业质量控制中的一个难题。这个课题也引起了高校及科研院所的关注，课题研究报告不少，但研究结论不一致，缺乏指导性结论。

2.1 固态发酵食醋被杂菌污染的关键生产环节研究

马净丽等[1，3]研究得出，生醋的长时间存放是引起污染菌的主要原因。通过对生产现场了解，车间在固态醋酸发酵生产过程中，确有生醋长时间存放的现象，由于固态醋酸发酵工艺所决定，生醋中还原糖和氨基酸等营养物丰富，并有少量残留乙醇，在存放过程中，存活的微生物中部分耐酸厌氧菌，利用其营养物质在醋液底部至中上部继续繁殖，耐酸好氧菌或兼性好氧菌则可在表面繁殖，其中的产酸菌可将醋液中的糖转化为酸，单从以产酸含量判断原料利用率，短时表象有益无害，可多批生醋连续存放后，难免就形成了与杂菌共生而变异的醋蛾子。由于现在具有一定规模的食醋生产企业，待配兑或待灭菌的生醋都是存放在容积几十至上百立方米的大罐中，进罐出罐的醋对液面的冲击，可在罐底找到像醋蛾子或红茶菌膜碎块的膜状物，醋液发黏、有纳豆的拉丝。

2.2 引起固态发酵食醋发黏、产气变质的微生物菌属研究

对于食醋中微生物污染菌的研究，分离鉴定的方法不同，样品的差异，研究结果也不一致。在9个研究报告中，得出导致食醋腐败变质的污染菌有8种不同的结论：鉴定为芽孢杆菌（Bacillus）2例；鉴定为类芽孢杆菌（Paenibacillus）1例；鉴定为葡糖杆菌属（Gluconobacter）1例；鉴定为牛痘乳杆菌（Lactobacillus vaccinostercus）1例；鉴定为耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）1例；鉴定分别为特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、腐生葡萄球菌（Staphalococcus saprophyticus）、头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1例；鉴定分别为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）1例；鉴定为引起腐败现象的致腐微生物是以稳定群落的形式存在1例。

2.2.1 采用传统分离鉴定方法判定污染菌的研究

王建云等[2]对发黏、劣变的食醋采用常规平板培养法37 ℃厌氧培养48 h，镜检后判定污染菌为芽孢杆菌。成剑锋[3]对变质食醋中的膜状物洗液，采用肉胨培养基30 ℃室温培养，对单一菌落进行芽孢染色、鞭毛染色后镜检，接触酶试验，再对照《伯杰氏细菌鉴定手册》，初步判定为污染菌为类芽孢杆菌属。张怀敏等[9]对导致老陈醋产气微生物的分离和鉴定中得到1株革兰氏阳性菌，经产气性、生理生化试验，并根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏系统细菌学手册》判断得出，产气菌株为芽孢杆菌。薛建华等[10]通过液体富集培养、平板涂布及划线的方式，结合验证试验，从食醋中分离出絮状物的产生菌，初步鉴定为葡糖杆菌属。

2.2.2 采用传统分离鉴定方法与16S rDNA 序列分析方法判定污染菌的研究

孙文丽等[11]从胀气食醋中分离到6株细菌，经鉴定分别为贝莱斯芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、头状葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。且各菌株均可在糖发酵培养基中产生白色絮状物沉淀，其中1株菌能产生气体，是造成食醋胀气的主要潜在微生物。曹晋宜等[12]通过传统培养与16S rDNA 序列同源性分析方法，并结合微生物宏基因组分类测序方法得出了引起食醋发黏的微生物主要是牛痘乳杆菌的结论。翟磊等[13]采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术以及纯培养技术，得到导致食醋变质污染菌株，通过分子生物学分析鉴定污染菌为耐酸乳杆菌。赵爽等[14]从产膜醋中分离的菌株，进行形态学特征和16S rDNA鉴定，结果证实，引起食醋产膜的菌株为木葡糖醋酸杆菌和巴氏醋杆菌。杨荣杰[15]根据形态特征观察及生理生化鉴定结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》中对芽抱杆菌的特征描述进行初步分类；16S rDNA序列测定与分析结果表明，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌可以导致食醋产膜、变浑浊。范晓军[16]利用Illumina HiSep高通量测序技术，对山西老陈醋夏冬两季不同发酵阶段的细菌菌群构成及演替进行深入分析，首次发现引起食醋腐败现象的致腐微生物以稳定群落的形式存在。

2.2.3 研究得出引起变质的污染菌中多数是固态醋酸发酵中的常见菌

有关文献报道[17-20]，乳酸菌、醋酸菌是主要的食醋酿造微生物，芽孢杆菌也是固态醋酸发酵中的常见菌。在多个地区的固态醋酸发酵醋醅中分离出巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌。研究表明[20-23]，芽孢杆菌是固态醋酸发酵过程中的重要微生物，芽孢杆菌在其体内不仅存在糖酵解途径，而且存在三羧酸循环的氧化代谢途径，其中间代谢产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸的存在，可以缓解挥发性醋酸的刺激气味。凝结芽孢杆菌在生长过程中可以产生乳酸，对食醋提高风味也是必不可少的[24-25]。固态开放式发酵过程中复杂的微生物代谢赋予了固态发酵食醋独特的风味及口感，但是对复杂微生物群落的酿造功能及其调控方法尚缺少深入了解。

2.3 固态发酵食醋中污染菌的检验方法研究

研究中采用国家标准检验法对已变质的食醋样品微生物检测，菌落总数几乎为0。当采用血球计数版显微镜观察计数时，活动菌≥106CFU/mL，不活动菌也≥106CFU/mL，其中多为杆菌和短杆菌。国家制定的食品安全国家标准《食品微生物学检验总则》、《食品微生物学检验菌落总数测定》和《食品微生物学检验调味品检验》检验方法标准已不适用于食醋出厂检验。

张继忠等[26-27]对我国食品微生物检测技术的分析中也证实了这个论点，国家制定的检测标准方法已经无法很好地适应当前的实际检测需求，在这一背景下，必须要提高检测技术的创新突破。

在2.2中引起固态发酵食醋发黏、产气变质的微生物菌属研究中，已介绍了研究中所采用的检测方法。无论何种方法，首先得采用传统的分离鉴定法得到单一菌株。可是在企业的验证试验中，即便是已经出现发黏、浑浊、产气的食醋样品，都很难获得疑似菌落，因为某些微生物物种难以培养和分离，并且完全依赖于微生物的表型性状也会导致错误的识别[28-30]。

2.4 固态发酵食醋中污染菌的控制方法研究

对污染菌实施控制的是企业，要制定一套完整、有效的生产全过程控制方法，主要依据是污染菌的定性、定量检测结果。准确的检测结果又必须建立在可信的检验方法上，鉴于目前虽有许多新技术在微生物检测上的成功应用报道，但都还是研究层面上的，尚无企业适用的检验方法。只能采用生醋应及时加热灭菌；最终醋产品的灭菌法采用高温一次灭菌法或二次灭菌法；加强生产过程的卫生管理，防止交叉污染的研究结论[1，3]。对目前防止固态发酵食醋产品货架期出现发黏、产气、浑浊等质量问题起到一定作用。

3 结论与展望

综上所述，目前对固态发酵食醋中污染菌的研究，初步认定可能导致固态发酵食醋发黏、产气、浑浊的污染菌是以稳定群落的形式存在，其中的菌属有醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌等。

这些菌在固态发酵食醋中对食醋的理化、风味质量是有益的。也正因为发酵过程中微生物的多样性，在生醋中存活的微生物也是多样性的，如果不及时灭菌存放，在营养丰富的液态低pH值环境下是否会产生变异，聚集形成危害食醋产品的杂菌菌膜，尚待深入研究。

上述研究对食醋生产一线的传统认知起到了一定的警示作用，杜绝了生醋的长时间存放，采用高温灭菌或二次灭菌法取代了传统巴氏灭菌法，加强生产过程的卫生管理，防止交叉污染。

存在的不足是研究结论不一致，食醋酿造行业内研究者难以从中获得一致性指导建议。研究中介绍的检验方法还停留在研究层面，没有一个对企业适用性强、准确、快速的检测方法及生产全过程的有效控制方法。

在今后的研究中综合各种食品微生物检验新技术的优势，不断优化组合，研究出更快、更方便、更灵敏的固态发酵食醋中污染菌的检测标准。