超高效液相色谱-串联质谱法快速测定调味料中5 种罂粟壳生物碱残留量

宁焕焱，黄秀丽，赖政炀，罗月珍，赵智锋

（惠州市食品药品检验所，广东 惠州 516003）

罂粟壳又名“御米壳”，俗称“米壳”，为罂粟科植物罂粟（Papaver somniferumL.）的干燥成熟果壳，含有20多种生物碱，以吗啡、可待因、罂粟碱、那可汀、蒂巴因5种异喹啉型生物碱为主，另含D-甘露庚酮糖、赤藓醇等[1]。罂粟壳因含生物碱，药理表现有一定的镇痛、镇咳、止泻作用，由于罂粟壳的易成瘾性[2]，国内有不法商贩将其加入调味料中，如火锅底料、调料、牛肉汤料等食品中，以达到吸引消费者的目的。消费者长期食用含有罂粟壳的食物，对人体肝脏、肾脏具有毒性损害作用，会使人成瘾、记忆性能衰退，严重可能对神经系统和消化系统造成损伤，甚至呼吸衰竭[3-4]。鉴于此，我国早在2000年已经将罂粟壳归类为“其他毒品”，2008年，中国卫生部发布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》[5]，罂粟壳就被列为非食用物质，严格监管，禁止在食品中添加，禁止非法供应、运输和使用。

目前，测定罂粟壳生物碱的方法主要有荧光法[6]、层析法[7]、分光光度法[8]、示波极谱法[9]、酶联免疫法[10]、气相色谱法[11]、液相色谱法[12]、气相色谱-质谱联用法[13]和液相色谱-质谱联用法[14-17]。其中，前五种方法只能定性和半定量测定，气相和液相色谱法因复杂基质易产生假阳性，气相色谱法、气相色谱-质谱联用法样品需衍生化处理，超高效液相色谱-质谱联用（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法因选择性好、重复性好、灵敏度高应用愈来愈广泛[16-18]。本研究采用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）预处理，脱脂去除干扰物。建立超高效液相色谱-串联质谱法同时测定调味料中5种罂粟壳生物碱的快速分析方法，以期提供一种调味料中罂粟壳生物碱的高效、灵敏、准确的检测技术，为食品安全突发事件及食品中违法添加监测及分析检测提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

调味料（牛肉汁调味料、调味料酒、火锅底料、火锅蘸料、复合调味粉、香辛料调味油）：市售；乙腈（色谱纯）：德国MERCK公司；乙酸乙酯、环己烷（均为色谱纯）：美国Thermo Scientific公司；甲酸（优级纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；无水硫酸镁、氯化钠（均为分析纯）：广州化学试剂厂；固相萃取（solid-phase extraction，SPE）净化萃取管[150 mg无水硫酸镁，50 mg 乙二胺-N-丙基硅烷，（primary secondary amine，PSA），50 mg C18]：美国Agilent公司；吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁混合标准溶液：美国Stanford Chemicals 公司。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪、Xevo TQ-S Micro三重四极杆质谱仪：美国Waters公司；SorvallTMST 16高速冷冻离心机：美国Thermo Fisher Scientific公司；Synergy超纯水机：德国Merck Millipore公司；XS204分析天平：瑞士MettlerToledo公司；MS3涡旋混合器：德国IKA公司；GT-2227QTS超声波清洗器：广东固特超声股份有限公司。

1.3 实验方法

吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁混合标准品溶液（质量浓度分别为50 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL、10 μg/mL、10 μg/mL），置于-18 ℃冷冻保存，用乙腈配制成储备液，以空白基质提取液稀释成浓度合适的标准工作溶液，置于棕色瓶中，4 ℃条件下保存备用。

1.3.2 样品处理方法

称取均质或混匀后样品2 g（精确至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加5 mL的0.2%甲酸水溶液，涡旋振荡1 min后，准确加入10 mL的0.2%甲酸乙腈，密塞，涡旋振荡3 min，超声提取30 min，加入3 g无水硫酸镁、3 g氯化钠，振摇1 min，以12 000 r/min离心5 min。

取上述离心上清液2 mL，置于5 mL或10 mL四氟乙烯具塞离心管中，4 ℃条件下，加2 mL乙酸乙酯-环己烷（2∶8，V/V）去除脂肪和磷脂，加无水硫酸镁、PSA、C18（3∶1∶1）混合粉末0.25 g，涡旋混合1 min，以12 000 r/min离心5 min，去除上层，移取乙腈层，经0.22 μm聚四氟乙烯滤膜过滤，待UPLC-MS/MS测定。

空白基质制备：根据配制标准工作曲线的使用量，称取适量空白基质样品，按上述步骤处理，用于配制标准工作溶液。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱：WatersUPLCHSST3（1.7μm，2.1mm×100 mm）；流动相：A相：含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液，B相：0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱：0～0.5 min，90%A；0.5～1.2 min，90%～60%A；1.2～1.8 min，60%A；1.8～2.5 min，60%～90.0%A；2.5～4.0 min，90%A；4.0～4.5 min，90%～60.0%A；4.5～6.0 min，90%。流速：0.4 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为2 μL。

基于创客教育的第二课堂的主体是大学生。大学生因为兴趣而自发参与，经过第二课堂的训练，成为具有较强实践能力的创客。

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子（electrospray ion，ESI）源；正离子模式；毛细管电压：1.0 kV；离子源温度：550 ℃；脱溶剂气流速：1 000 L/h；锥孔气流速：50 L/h，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式采集，其他参数见表1。

表1 5种罂粟壳生物碱的质谱参数Table 1 Mass spectrum parameters for five alkaloids of poppy husk

1.3.5 方法学考察

对实验进行方法学验证，确保方法可行。以DL=3Sb/S=3Sb×C/X计算检出限，并为系列混合标准溶液确认各自的线性范围；以完全等同条件多组测定（n=6），分析计算相对标准偏差，验证精密度，保证结果的重复性和再现性；以低、中、高3个标品添加水平重复5次计算测定加标回收率，验证准确度及灵敏度；使其保持良好置信度和检验状态，确保检测结果准确、可靠。

2 结果与分析

2.1 提取、净化方法的选择优化

罂粟碱中5种生物碱通常以盐酸溶液、酸化乙醇、酸化乙腈、氨化甲醇为提取溶剂。因为蒂巴因、那可丁几乎不溶于水，而采用氨化甲醇提取最终会抑制ESI+模式下目标化合物的电离，比较研究上述溶液的提取效果，0.2%甲酸乙腈作为提取溶剂实验效果理想。

当前，针对罂粟碱生物碱的前处理大部分采用固相萃取小柱净化，常用的MCX 固相萃取柱除油脂、磷脂效果不佳，HLB固相萃取柱对小分子干扰物去除不佳，该法试验成本高、操作繁琐[19-20]。实验发现，采用QuEChERS前处理样品，低温条件下经乙酸乙酯-环己烷（2∶8，V/V）脱脂后，则能达预期较好的净化效果，该法操作简便且缩短了检测周期。

2.2 色谱条件的优化

5种生物碱分子结构各不相同，吗啡和可待因分子结构中因带有酚羟基，极性较强，蒂巴因、那可丁极性较弱。由于选择质谱ESI+模式分析，为使靶标出峰快、响应好，使用酸性流动相。比较研究了5 mmol/L乙酸铵溶液、0.2%甲酸5 mmol/L甲酸铵溶液、0.1%甲酸10 mmol/L甲酸铵溶液分别配比0.1%甲酸甲醇、乙腈6种流动相搭配，结果发现含0.1%甲酸10 mmol/L甲酸铵-乙腈响应理想，色谱分离度、峰型最好。

图1 5种罂粟壳生物碱混合标准溶液的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of five alkaloids of poppy husk in a standard solution

比较研究反相色谱柱：Waters UPLC HSS T3（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Waters BHE C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Shim-pack GIS C18（2.0 μm，2.1 mm×100 mm）对罂粟壳中5种生物碱的分离效果，总离子流图见图1。由图1可知，T3柱在相同梯度洗脱条件下，对5种化合物的分离度较高、峰形最佳，5 种物质5 min内全部出峰。5 种物质的保留时间分别为吗啡（0.90 min）、可待因（2.37 min）、蒂巴因（2.77 min）、罂粟碱（3.05 min）、那可丁（3.38 min），色谱峰分离良好、无拖尾、无叉峰、峰形好。

2.3 质谱条件的优化

采用电喷雾正离子模式（ESI+）分析目标化合物，根据5种生物碱的分子结构特征，通过手动调谐和自动调谐相结合的方式优化质谱参数，选取灵敏度好、丰度高、干扰小的碎片离子作为定性、定量离子，建立多离子反应监测（MRM）方法。

2.4 方法验证

2.4.1 线性范围和检出限

采用空白基质制备系列混合标准工作溶液，以质量浓度（x，μg/L）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制5种罂粟壳生物碱的标准曲线，得到5 种生物碱的标准曲线回归方程、相关系数R，以信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）=3确定待测物的检出限（limit of detection，LOD），SNR=10确定待测物的定量限（limits of quantitation，LOQ），检出限和定量限见表2。由表2可知，其中吗啡、可待因在0.50～200 μg/L质量浓度范围内呈现良好的线性关系，蒂巴因在0.05～50 μg/L质量浓度范围内呈现良好的线性关系，盐酸罂粟碱和那可丁在0.10～100 μg/L质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数R均＞0.999。吗啡、可待因的检出限和定量限分别为3.0 μg/kg、10.0 μg/kg；蒂巴因、盐酸罂粟碱和那可丁的检出限和定量限分别为0.6 μg/kg、2.0 μg/kg。

表2 5种罂粟壳生物碱的线性范围、线性方程、相关系数R、检出限和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantitation of five alkaloids in poppy husk

2.4.2 回收率、精密度试验

调味品阴性样品中分别添加低、中、高3个不同浓度水平的混合标准溶液，每个添加水平重复6次，吗啡、可待因的添加水平为2.5 μg/kg、25.0 μg/kg、50.0 μg/kg，罂粟碱、那可丁、蒂巴因为0.5 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg。以基质空白工作曲线回归方程进行定量，计算方法的回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。

表3 5种罂粟壳生物碱的精密度及加标回收率试验结果Table 3 Results of precision and standard recoveries rate tests of 5 kinds of poppy husk

5种罂粟壳生物碱的平均回收率为65.7%～108.2%，回收率试验结果相对标准偏差（RSD）为1.24%～8.71%，精密度试验结果相对标准偏差为0.43%～1.85%。结果表明，该方法的精密度、准确度良好，可以满足调味品中5 种罂粟壳生物碱的痕量分析测定要求。

2.4 调味料中罂粟壳生物碱的检测

以超市和农批市场所购买的6种不同品种调味料进行检测，同时做1个质控样品，应用该方法分别检测5种罂粟壳生物碱，结果见表4。由表4可知，火锅底料有检出，呈阳性，复检做平行样取平均值，该火锅底料做质控样并以表3对应添加水平计算其含量，其余5种样品呈阴性，表明调味品中仍存在非法添加现象，未来将进一步扩大检测范围，为监管提供技术保障。

表4 不同品种调味料中5种罂粟壳生物碱含量的检测结果Table 4 Determination results of five alkaloids of poppy husk contents in different kinds of seasonings μg/kg

3 结论

本实验建立了高效液相色谱-串联质谱法同时检测调味品中5种罂粟碱的分析方法，在提取和净化过程中采用QuEChERS 前处理方法，乙酸乙酯-环己烷（2∶8）脱脂，有效去除了杂质对目标检测物的干扰，降低基质效应，同时优化了仪器检测参数，提高了检测的灵敏度。该方法快速、简便、灵敏、准确，精密度试验结果相对标准偏差为0.43%～1.85%，回收率在65.7%～108.2%之间，相对标准偏差为1.24%～8.71%，表明该方法精密度及准确度良好，检测速度快，适用于调味品中非法添加罂粟壳的定性定量检测，能为大批量检测保驾护航，同时，为食品安全监管工作提供技术支持和参考。