肝癌分化程度与肝脏CT强化特点及CD34、p53、GPC3、CK19、Ki-67表达的关系

杨晓珍，龙江，赵鹏，高文峰，张永宏

首都医科大学附属北京佑安医院肿瘤微创介入治疗中心，北京 100069

原发性肝癌的发病率居中国恶性肿瘤的第4位，病死率居第3位[1]，严重威胁人们的健康。尽管先进影像设备的应用明显提高了肝癌患者的检出率，但是计算机体层摄影（computerized tomography，CT）仍然是大部分医院所采用的主要放射影像诊断设备；同时，对于部分早期肝癌患者，病理诊断是必要的诊断依据。在肝癌的病理诊断中，如果发现肿瘤组织中的窦内皮细胞标志物CD34染色阳性，即提示肝窦已经转变为肿瘤性毛细血管网。CD34的阳性表达程度与毛细血管的密集程度有关，是肿瘤转移的重要因素。p53蛋白过度表达是肝癌低分化、高转移潜能的生物学标志物。人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican 3，GPC3）基因编码的蛋白属于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，通过糖基磷脂酰肌醇锚蛋白锚定在细胞表面，可以结合肝素结合型蛋白如生长因子，调控细胞的生长、增殖、分化、黏附和迁移等行为，还可能涉及抑制或调节大部分的中胚层组织。细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）是一种低分子角蛋白，是细胞骨架蛋白的一种亚型，属于胆管细胞型细胞角质素。肝细胞不表达CK19；而在肝癌细胞和间质中假胆管可阳性着色。Ki-67是一种增殖细胞相关抗原，在肝癌组织中呈阳性表达。不同指标的表达与肝癌分化程度的相关性分析，有助于进一步了解肝癌患者预后。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2010年1月18日至2010年12月17日于首都医科大学附属北京佑安医院诊治的肝癌患者的临床资料。纳入标准：①经肝占位活检证实为肝癌；②接受肝动脉导管介入治疗或消融治疗；③接受CT平扫+增强扫描；④临床资料完整。排除标准：无病理结果或有肝癌以外的肝占位疾病。根据纳入排除标准，共纳入40例肝癌患者，其中男34例，女6例；年龄为38～78岁，平均年龄为（54.40±9.89）岁；乙肝35例，丙肝2例，自身免疫性肝病1例，无肝炎、自身免疫性肝病的病例2例。

1.2 观察指标

统计患者的病理分化程度，比较不同分化程度肝癌患者的CK19、CD34、p53、GPC3表达情况。分析患者肝脏CT平扫+增强扫描的表现，肝组织的三期动脉CT值及病灶有无包膜、有无边界、是否均匀强化，淋巴结转移情况，肿瘤远处转移情况，TNM分期情况。比较不同甲胎蛋白水平的肿瘤分化程度。

1.3 检查方法

1.3.1 病理组织免疫组化检查 肝癌组织常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，采用链霉素亲生物素-过氧化物酶法检测CK19、CD34、GPC3、P53、Ki-67 的表达水平。将 CD34、p53、GPC3、CK19表达分为-至+++，其中-表示阴性，+-表示弱阳性，+、++、+++均表示阳性。Ki-67表达范围为0～0.90，本研究所表达数值分别涵盖0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90。肝癌的分化程度分为低分化、低中分化、中分化、中高分化、高分化。

1.3.2 CT扫描 采用GE lightspeed VCT 64层螺旋CT机进行CT平扫+增强扫描。探测器宽度40 mm（0.625 mm×64层），管电流为380 mA，管电压为120 kV，层厚为5 mm，层间距为5 mm；重组层厚为0.625 mm，层间距为0.625 mm。增强扫描：高压注射器经肘前静脉注入碘普胺（370 mgI/ml）100 ml，流速为3 ml/s；动脉期扫描20～25 s，门脉期扫描65～70 s，延迟期扫描3 min；测量时尽量覆盖全部病灶范围，避开血管、胆管、肿瘤坏死区域。分别测量感兴趣区和肿瘤周围正常肝组织的三期动脉CT值。记录病灶有无包膜、有无边界、是否均匀强化，淋巴结转移情况，肿瘤远处转移情况及TNM分期情况[2]。

1.3.3 甲胎蛋白检测 收集本研究40例患者于检验科检查所得的甲胎蛋白值数据。甲胎蛋白＜200 ng/ml，为正常或轻度升高；甲胎蛋白为200～400 ng/ml，为中度升高；甲胎蛋白＞400 ng/ml，为重度升高。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验；计数资料以例数或率（%）表示，采用χ2检验；等级资料比较采用秩和检验；相关性分析采用Spearman法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分化程度

40例肝癌患者中，低分化占30%（12/40），中低分化占10%（4/40），中分化占50%（20/40），中高分化占0%（0/40），高分化占10%（4/40）。

2.2 不同分化程度肝癌患者的CK19、CD34、p53、Ki-67、GPC3表达情况

12例低分化患者的CK19表达：-7例，+-1例，+4例；4例低中分化：-1例，+-2例，+1例；20例中分化：-18例，+2例；4例高分化：-3例，+1例。不同分化程度肝癌患者的CK19表达情况比较，差异有统计学意义（χ2=8.658，P=0.034）；而不同分化程度肝癌患者的CD34、p53、GPC3表达情况比较，差异均无统计学意义（χ2=3.055、4.048、3.182，P＞0.05）（表1）。低分化、低中分化、中分化、中高分化、高分化患者Ki-67表达的中位数分别为0.60（0.60～0.90）、0.80（0.20～0.80）、0.80（0～0.90）、0（0）、0.05（0.05～0.70），差异无统计学意义（χ2=0.856，P＞0.05）；低分化、低中分化、中分化、中高分化、高分化患者Ki-67表达的众数分别为0.60、0.80、0.80、0、0.05。Spearman相关性分析显示，肝癌的分化程度与Ki-67表达众数呈负相关（r=-0.344，P=0.030）。

表1 不同分化程度肝癌患者的CK19、CD34、p53、GPC3表达情况

2.3 CT平扫和增强扫描的表现

平扫：40例患者中1例为高密度（低分化），39例为低密度（低分化例11，中低分化4例，中分化20例，高分化4例）。增强扫描：动脉期扫描，肝组织均有强化；门脉期扫描，等密度1例（低分化），高密度1例（中分化），低密度38例（低分化11例，中低分化4例，中分化19例，高分化4例）；延迟期扫描，低密度39例（低分化12例，中低分化4例，中分化19例，高分化4例），高密度1例（中分化）。病灶门脉期扫描的CT值高于动脉期的患者：低分化4例，中低分化2例，中分化10例，高分化1例；病灶门脉期扫描的CT值高于动脉期的患者病灶门脉期扫描的平均CT值为（93.85±12.60）HU，明显高于动脉期的（79.21±23.45）HU，差异有统计学意义（t=3.478，P=0.001）。病灶门脉期扫描的CT值低于动脉期的患者：低分化8例，中低分化2例，中分化10例，高分化3例；病灶门脉期扫描的CT值低于动脉期的患者病灶门脉期扫描的平均CT值为（83.19±10.53）HU，低于动脉期的（88.6±12.64）HU，差异有统计学意义（t=2.080，P=0.041）。病灶门脉期扫描CT值高于动脉期的患者与病灶门脉期扫描CT值低于动脉期的患者的低分化、中低分化、中分化、高分化的例数比较，差异无统计学意义（Z=0.297，P=0.787）。低分化、中低分化、中分化、高分化患者病灶有包膜的例数分别为3例、1例、7例、1例，无包膜的例数分别为9例、3例、13例、3例，两者比较，差异无统计学意义（Z=0.385，P=0.738）。低分化、中低分化、中分化、高分化患者病灶无边界的例数分别为9例、2例、9例、1例，有边界的例数分别为3例、2例、11例、3例，两者比较，差异无统计学意义（Z=1.943，P=0.074）。低分化、中低分化、中分化、高分化患者均匀强化的例数分别为0例、1例、4例、4例，不均匀强化的例数分别为12例、3例、16例、0例，两者比较，差异有统计学意义（Z=3.168，P=0.002）。

2.4 TNM分期、淋巴结转移及肿瘤远处转移情况

TNM分期：Ⅰ期24例（低分化8例，中分化12例，高分化4例），Ⅱ期3例（中分化1例，中低分化2例），Ⅲa期8例（低分化1例，中低分化1例，中分化6例），Ⅲc期1例（低分化），Ⅳa期1例（中低分化），Ⅳb期3例（中分化1，低分化2例）。不同TNM分期患者的肿瘤分化程度比较，差异无统计学意义（χ2=3.275，P=0.513）。淋巴结转移2例：中低分化1例，中分化1例。肿瘤远处转移3例：低分化2例，中分化1例。

2.5 不同甲胎蛋白水平患者的分化程度比较

16例患者的甲胎蛋白水平＜200 ng/ml，其分化程度为低分化3例、中低分化2例、中分化7例、高分化4例；6例患者的甲胎蛋白水平为200～400 ng/ml，其分化程度为低分化2例、中分化4例；18例甲胎蛋白水平＞400 ng/ml，其分化程度为低分化7例、中低分化2例、中分化9例。不同甲胎蛋白水平患者的分化程度比较，差异无统计学意义（χ2=5.908，P=0.052）。

3 讨论

CK19属于胆管细胞型细胞角质素，一般认为肝细胞不表达CK19[3]。本研究结果显示，CK19表达为+的患者肿瘤分化程度较低，推测CK19阳性表达与预后不好有关。这与其他学者的研究结果一致[4]。此外，研究显示，CK19表达与肿瘤侵袭密切相关[5]。

本研究显示，CT扫描时不同分化程度的肝癌病灶强化的均匀程度有差别。这可能是分化程度低的病灶生长快及自发坏死等原因导致了病灶强化不均匀。

Ki-67抗原是一种增殖细胞标志抗原，其表达随细胞周期的不同而发生改变。Ki-67出现在G1中期至晚期，S期和G2期逐渐增加，M期达到最高值，G0期细胞不表达。Ki-67抗原与多种肿瘤细胞的增殖活性、细胞周期以及肿瘤的生长方式、复发、转移等多种生物学行为相关。本研究中，虽然不同分化程度的Ki-67表达情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但分析40例患者的Ki-67抗原表达结果可见：低分化患者的Ki-67表达众数为0.6，低中分化为0.8，中分化为0.8，高分化为0.05。Spearman相关性分析显示，肝癌的分化程度与Ki-67表达众数呈负相关。Ki-67表达越弱，该病灶的分化程度高；反之，分化越低，Ki-67表达越强[6]。

CD34在癌旁及正常肝组织肝窦处无阳性表达；在癌组织中呈阳性表达，阳性染色局限于血管内皮细胞的细胞膜和细胞质，呈条状或环状，弥漫分布[7]。本研究显示，不同分化程度患者的CD34表达情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），该结果与其他学者提出的观点不一致。有学者提出，CD34高表达，肝癌分化程度低，可作为肝癌预后的预测因子，其机制在于CD34可预示微血管受侵情况，其阳性程度越高，越支持微血管受侵，肿瘤转移的可能性随之升高，直接影响患者的治疗及预后[8]。

有学者提出，肝癌的病理分化程度与延迟期病灶密度负相关，延迟期病灶密度越高，病理分化程度越低[9]。与其他学者得出的“分化差的肿瘤廓清较早”的结论[10]相反。本研究中病灶门脉期扫描CT值高于动脉期的患者与病灶门脉期扫描CT值低于动脉期的患者的低分化、中低分化、中分化、高分化的例数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），推测肝癌患者的CT值（病灶密度）可能与分化程度无关。这与上述研究结论不一致，考虑与本研究中等密度病例太少有关，可能存在偏倚。

本研究中不同分化程度患者的p53、GPC3的表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同分化程度患者病灶有无包膜、有无边界情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究有待进一步补充病例，增加样本量及分层分析将有助于得到更科学的结论，但即便是小样本，也同样为临床研究提供一定的启发。