藏药香芸火绒草化学成分及抗菌活性研究

徐云玲，祝汪洋，谭静玲，张 浩

1湖北四环制药有限公司，武汉 430056；2湖北省药品监督检验研究院，武汉430075

香芸火绒草(LeontopodiumhaplophylloidesHand.-Mazz.)系菊科火绒草属多年生草本植物，在我国主要分布于青海东部地区、四川西部和北部、甘肃西南部[1]，为当地藏族常用药，具有清热、凉血、消炎、利尿等功效。其化学成分主要包括苯丙素类、黄酮及挥发油类[2]。有文献记载香芸火绒草挥发性成分对病原真菌具有明显的抑制作用[2-3]。为更好地开发利用该药用资源，本实验对该植物地上部分进行了系统的化学成分研究和抑菌效应评价实验，从药理活性较高的二氯甲烷和乙酸乙酯部位进行化学成分研究，从中分离得到17个化合物，经理化性质及波谱分析分别鉴定为咖啡酸(caffeic acid，1)、咖啡酸-β-苯乙醇酯(phenethyl caffeate，2)、原儿茶酸(protocatechuic acid，3)、tyrosol(4)、对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid，5)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，6)、异莨菪亭(isoscopoletin，7)、7-(2,3-epoxy-3-methyl-3-butyloxy)-6-methoxycoumarin(8)、洋芹素(apigenin，9)、牡荆素(vitexin，10)、5-羟基-4′,7-二甲氧基-6,8-二甲基黄酮(5-hydroxy-4′，7-dimethoxy-6，8-dimethyl flavones，11)、5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮(5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone，12)、百蕊草素Ⅲ(kaempferol 3-glucorhamnoside，13)、methyl flavogallonate(14)、3,5,7,3′,4′-pentahydroxyflavone(15)、木犀草素(luteolin，16)、高良姜素(galangin，17)。化合1～16为首次从该植物中分离得到。

1 仪器与材料

Varian UNITYINOVA-600型超导核磁共振仪(美国瓦里安公司)；Agilent 1260型高效液相色谱仪、Agilent Eclipse XDB-C18分析色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm)(美国Agilent公司)； EYELA SB-1000型旋转蒸发仪(日本EYALA公司)；JP-020型台式实验室用超声波清洗器(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；ODS RP-18 (40～60 μm)柱色谱填料和RP-18 F254薄层预制板(美国Merck 公司)；柱色谱硅胶(200～300 目)及薄层色谱硅胶G(青岛海洋化工厂)；硅胶 GF254薄层预制板(烟台化学工业研究所)；Sephadex LH-20柱色谱凝胶(瑞典Amersham Biosciences公司)；液相色谱试剂甲醇、乙腈为市售色谱纯，其它所用试剂均为市售分析纯。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢菌均购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

本实验中所用香芸火绒草药材采于四川甘孜州道孚境内，由陈敬炳(研究员，湖北省中医院)主任药师鉴定为菊科火绒草属植物香芸火绒草LeontopodiumhaplophylloidesHand.-Mazz。

2 提取与分离

取香芸火绒草地上部分12 kg，粉碎，用75%乙醇浸泡，加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩， 得棕黑色浸膏。浸膏用水分散后依次用等体积二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取。萃取液减压浓缩得氯仿部位 140 g、乙酸乙酯部位87 g、正丁醇部位68 g。其中乙酸乙酯部位和正丁醇部位分别经反复硅胶柱色谱、 Sephadex LH-20 纯化，分离得到化合物7(6.3 mg)、8(7.8 mg)、9(9.7 mg)、10(8.3 mg)、11(6.9 mg)、12(7.1 mg)、13(22.6 mg)、14(5.8 mg)、15(7.9 mg)、16(16.8 mg)、17(32.5 mg)。运用制备薄层色谱、重结晶等方法从二氯甲烷部位分离得到化合物1(14.5 mg)、2(6.2 mg)、3(15.0 mg)、4(13.4 mg)、5(8.5 mg)、6(17.5 mg)。

3 结构鉴定

化合物1橘黄色颗粒状固体(丙酮);1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.11(lH，brs，1-COOH)，9.51(1H，brs，OH)，9.17(1H，brs，OH)，7.61(1H，d，J=3.6 Hz，H-3)，7.11(1H，d，J=3.0 Hz，H-5)，7.01 (1H，dd，J=9.6，2.4 Hz，H-9)，6.79(1H，d，J=8.4 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=13.2 Hz，H-2)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：167.9(C-1)，148.2(C-6)，145.4(C-7)，144.3(C-3)，125.2(C-4)，119.9(C-9)，115.8(C-8)，114.9(C-2)，114.5(C-5)。以上数据与文献[4]对照基本一致，故确定化合物1为咖啡酸。

化合物2白色晶体(二氯甲烷);1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.73(1H，d，J=15.6 Hz，H-8)，7.51(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，7.41(2H，d，J=6.6 Hz，H-4′，8′)，7.29～7.32(1H，m，H-6′)，7.24-7.27(2H，m，H-5′，7′)，7.17(1H，d，J=3.0 Hz，H-2)，7.13(1H，dd，J=3.6，9.0 Hz，H-6)，6.98(1H，d，J=9.6 Hz，H-5)，3.12(2H，t，J=7.2 Hz，H-1′)，4.41(2H，t，J=10.8 Hz，H-2′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：166.9(C-9)，143.9(C-4)，143.1(C-3)，141.6(C-7)，131.9(C-3′)，128.8(C-1)，128.6(C-5′，7′)，125.9(C-6′)，125.7(C-4′，8′)，122.0(C-6)，116.5(C-2)，116.5(C-5，8)，69.3(C-1′)，28.5(C-2′)。以上数据与文献[5]对照基本一致，故确定化合物2为咖啡酸-β-苯乙醇酯。

化合物3白色粉末(甲醇);1H NMR (600 MHz，CD3OD)δ：7.63(1H，s，H-2)，7.50(1H，H-8)，6.82(1H，J=8.1 Hz，H-5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：123.7(C-1)，117.7(C-2)，148.1(C-3)，152.9(C-4)，114.0(C-5)，123.8(C-6)，170.3(C-7)。以上数据与文献[6]对照基本一致，故确定化合物3为原儿茶酸。

化合物4无色针晶(丙酮);1H NMR (600 MHz，CD3OD)δ：7.12(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.70(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，3.78(2H，t，J=7.2，7.2 Hz，H-8)，2.80 (2H，d，J=7.2 Hz，H-7)；13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：131.3(C-1)，131.2(C-2，6)，116.4(C-3，5)，157.1(C-4)，39.7(C-7)，64.8(C-8)。以上数据与文献[7]对照基本一致，故确定化合物4为tyrosol。

化合物5无色针晶(甲醇);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.98(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.92 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3，5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：170.4(C-7)，163.7(C-4)，133.3(C-2，6)，123.0(C-1)，116.3(C-3，5)。以上数据与文献[8]对照基本一致，故确定化合物5为对羟基苯甲酸。

化合物6无色针晶(二氯甲烷);1H NMR(600 MHz ，Pyr-d5)δ：7.75(2H，dd，J=3.6，2.0 Hz，H-3，6)，7.40(2H，dd，J=2.0，3.6 Hz，H-4，5)，4.25(4H，m，H-7，7′)，1.53(4H，m，H-8，8′)，1.23(4H，m，H-9，9′)，0.74(6H，t，J=7.2 Hz，H-10，10′)；13C NMR(600 MHz ，Pyr-d5)δ：167.9(C-7，7′)，133.2(C-1，2)，131.5(C-4，5)，129.4(C-3，6)，65.7(C-8，8′)，30.9(C-9，9′)，19.5(C-10，10′)，13.9(C-11，11′)。以上数据与文献[9]对照基本一致，故确定化合物6为的邻苯二甲酸二丁酯。

化合物7白色针晶(丙酮);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.95 (1H，d，J=9.6Hz，H-4)，7.19(1H，s，H-5)，6.85 (1H，s，H-8)，6.30(1H，dd，J=9.6 Hz，H-3)，4.00(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：164.4(C-2)，153.1(C-7)，151.7(C-9)，147.3(C-6)，146.4(C-4)，112.8(C-3)，112.8(C-10)，110.2(C-5)，104.2(C-8)，57.2(C-OCH3)。以上数据与文献[10]对照基本一致，与异莨菪亭对照品薄层比较，二者的薄层层析行为一致，确定化合物7为异莨菪亭。

化合物8黄色粉末(甲醇)，浓硫酸乙醇试剂反应显棕褐色;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：9.89(1H，s，6-OH)，6.26(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)，7.59(1H，d，J=9.0 Hz，H-4)，6.89(2H，s，H-5)，6.82(2H，s，H-8)，3.65(3H，s，6-OCH3)，4.54～4.70(2H，m，H-1′)，3.62(1H，m，H-2′)，1.43(3H，s，H-4′)，1.42(3H，s，H-5′)；13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：161.4(C-2)，113.5 (C-3)，144.0 (C-4)，109.4 (C-5)，147.0(C-6)，153.7 (C-7)，100.6(C-8)，150.6 (C-9)，112.0(C-10)，56.4(6-OCH3)，68.8(C-1′)，60.8(C-2′)，56.4(C-3′)，25.0(C-4′)，18.3(C-5′)。以上数据与文献[11]对照基本一致，故确定化合物8为7-(2，3-epoxy-3-methyl-3-butyloxy)-6-methoxycoumarin。

化合物9淡黄色粉末状结晶(丙酮)，盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish反应呈阴性;1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：13.03(1H，s，5-OH)，8.07(2H，s，H-2′，6′)，7.16(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.97(1H，s，H-3)，6.46(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.09(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：177.9(C-4)，166.1(C-7)，162.9(C-2)，161.0(C-5)，158.7(C-9)，131.1(C-2′，6′)，124.0(C-1′)，116.7(C-3′，5′)，104.9(C-3)，99.8(C-6)，95.0(C-8)。以上数据与文献[12]对照基本一致，故确定化合物9为洋芹素。

化合物10黄色粉末(甲醇)。盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish反应阳性;1H NMR(600 MHz，Pyr-d5)δ：13.83(lH，s，5-OH)，8.32(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，8.29(2H，d，J=9.6 Hz，H-3′，5′)，6.81(lH，s，H-3)，6.69(1H，s，H-6)，4.83(lH，d，J=12.0 Hz，H-1′′)，3.92(lH，dd，J=12.6，3.0 Hz，H-6′′a)，3.81(lH，dd，J=12.6，7.2 Hz，H-6"b)，3.51(lH，m，H-4′′)，3.49(lH，m，H-5′′)，3.43(lH，m，H-2")，3.29(lH，m，H-3′′);13C NMR (150 MHz，Pyr-d5)δ：182.8(C-4)，164.9(C-2)，162.8(C-5)，162.7(C-4′)，162.5(C-7)，158.0(C-9)，129.8(C-2′，6′)，122.2(C-1′)，116.5(C-3′，5′)，106.0(C-8)，105.8(C-10)，103.0(C-3)，99.5(C-6)，83.3(C-5′′)，81.1(C-3′′)，75.6(C-1′′)，72.9(C-2′′)，72.6(C-4′′)，62.6(C-6′′)。以上数据与文献[13]对照基本一致，故确定化合物10为牡荆素。

化合物11黄色针状结晶(丙酮)，盐酸-镁粉反应呈阳性;1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：13.02(1H，s，5-OH)，8.06(2H，s，H-2′，6′)，7.14(2H，s，H-3′，5′)，6.98(1H，s，H-3)，3.86、3.76(3H，each，-OCH3)，2.10、2.35(3H，each，-CH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：182.6(C-4)，163.68(C-7)，162.4(C-4′)，162.1(C-2)，156.3(C-5)，152.37(C-9)，128.3(C-2′，6′)，122.9(C-1′)，114.7(C-3′，5′)，113.1(C-6)，108.7(C-8)，106.5(C-10)，103.5(C-3)，60.3、55.5(4′，7-OCH3)。以上数据与文献[14]对照基本一致，故确定化合物11为5-羟基-4′，7-二甲氧基-6，8-二甲基黄酮。

化合物12黄色针状结晶(丙酮)，TLC薄层板上喷1%AlCl3-乙醇溶液后置紫外灯下显鲜黄色荧光;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：12.51(1H，s，5-OH)，10.82(1H，s，7-OH)，6.99(1H，t，J=8.4 Hz，H-4′)，6.31(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：182.0(C-4)，163.0(C-2)，157.4(C-7)，156.2(C-5)，149.6(C-9)，132.0(C-4′)，130.8(C-1′)，129.2(C-3′，5′)，127.8(C-8)，126.2(C-2′，6′)，105.0(C-3)，103.7(C-10)，99.1(C-6)，61.0(8-OCH3)。以上数据与文献[15]对照基本一致，故确定化合物12为5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮。

化合物13黄色针晶(甲醇)，TLC薄层板上喷5%香草醛-浓硫酸喷雾后加热显黄色;1H NMR (600 MHz，CD3OD)δ：12.41(1H，s，5-OH)，8.13(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.99(2H，d，J=7.2 Hz，H-3′，5′)，6.48(1H，s，H-8)，6.27(1H，s，H-6);13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：176.9(C-4)，165.3(C-7)，161.7(C-5)，159.3(C-4′)，157.2(C-9)，147.6(C-2)，137.5(C-3)，129.2(C-2′，6′)，123.7(C-1′)，116.4(C-3′，5′)，103.9(C-1′)，99.3(C-6)，94.5(C-8).以上数据与文献[16]对照基本一致，故确定化合物13为百蕊草素Ⅲ。

化合物14淡黄色无定形粉末(甲醇)，盐酸-镁粉反应呈阳性;1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.47(1H，s，H-5′)，7.07(1H，s，H-6′′)，3.43(3H，s，OCH3);13C NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：166.2(C-7′′)，159.0(C-7′)，157.3(C-7)，147.6(C-4′)，146.0(C-4)，144.0(C-5′′)，143.7(C-3′′)，139.2(C-3′)，138.2(C-3)，137.3(C-2′)，136.3(C-2)，135.5(C-4′′)，125.4(C-1′′)，118.8(C-6)，118.2(C-2′′)，112.8(C-1′)，111.5(C-1)，119.9(C-6)，109.1(C-5)，107.5(C-5′)，107.4(C-6′′)，51.3(C-OCH3)。以上数据与文献[17]对照基本一致，故确定化合物14为methylflavogallonate。

化合物15黄色粉末(甲醇)，盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish反应为阳性，AlCl3显色呈黄绿色;1H NMR(600 MHz，Pyr-d5)δ：13.21(1H，s，5-OH)，11.79(2H，s，4′，7-OH)，8.50(1H，d，J=1.8 Hz，3′-OH)，8.00(1H，dd，J=1.8，1.8 Hz，H-2′)，7.28(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.65(1H，d，J=1.8 Hz，H-5′)，6.61(1H，d，J=1.8 Hz，H-8);13C NMR (150 MHz，Pyr-d5)δ：177.4(C-4)，165.6(C-7)，162.6(C-9)，157.6(C-5)，147.9(C-2)，147.2(C-3′，4′)，138.0(C-3)，121.2(C-1′，6′)，116.8(C-2′，5′)，104.6(C-10)，99.33(C-6)，94.40(C-8)。以上数据与文献[18]对照基本一致，故确定化合物15为3，5，7，3′，4′-pentahydroxyflavone。

化合物16黄色粉末(甲醇)，TLC薄层板上喷1%AlCl3-乙醇溶液后置紫外灯下显鲜黄色荧光;1H NMR (600 MHz，Pyr-d5)δ：13.21(1H，s，5-OH)，11.26(2H，m，7-OH)，11.03(1H，m，3′，4′-OH)，7.29(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.69(1H，d，J=1.8 Hz，H-5′)，6.61(1H，s，H-3)，6.49(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.22(1H，m，H-6)；13C NMR (150 MHz，Pyr-d5)δ：179.9(C-4)，165.6(C-7)，165.0(C-2)，162.5(C-9)，157.6(C-5)，150.4(C-4′)，147.2(C-3′)，121.5(C-1′)，121.1(C-6′)，116.8(C-5′)，114.0(C-2′)，104.6(C-10)，103.5(C-3)，99.3(C-6)，94.4(C-8)。以上数据与文献[19]对照基本一致，故确定化合物16为木犀草素。

化合物17黄色针晶(丙酮)，盐酸-镁粉反应呈阳性;1H NMR (600 MHz，CDCl3)δ：12.25(1H，brs，7-OH)，8.20(2H，d，J=7.8 Hz，H-2′，6′)，7.46～7.55(3H，m，H-3′～5′)，6.53(1H，s，H-6)，6.22(1H，s，H-8)，2.54(2H，s，5，3-OH)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：176.6(C-4)，164.3(C-7)，161.2(C-5)，157.1(C-9)，145.6(C-2)，137.1(C-3)，131.1(C-10)，130.0(C-4′)，128.5(C-2′，6′)，127.6(C-3′，5′)，103.3(C-1′)，98.3(C-6)，93.7(C-8)。以上数据与文献[20]对照基本一致，故确定化合物17为高良姜素。

4 结论

本研究从香芸火绒草中分离鉴定得到17个化合物，包括苯丙素类、黄酮类、香豆素类等成分。针对分离得到的化合物进行抗菌活性筛选。采用培养基打孔法，测定化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及蜡状芽孢菌的抗菌作用，使用处于对数生长期的菌种，所有样品均使用丙酮溶解配制成5 mg/mL的药液。抑菌圈的直径大小可以用来说明不同化合物的抗菌作用的强弱，以纯丙酮为对照。通过测量各抑菌圈直径，计算抑菌率[抑菌率=对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100%)]，结果表明化合物1、2、4～6、9、10、13～17对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及蜡状芽孢杆菌均有抑制作用，其抑制率达到60%以上。该植物中化合物13、16和17含量较大，今后有望利用其植物细胞组织培养或结构修饰，以获得更多化合物，拓宽该植物的生物活性研究的内容。