供体特异性调节性T细胞在肝移植免疫耐受中的意义

王凯，高伟

作为治疗各种终末期肝病的有效手段，肝移植的存活率大幅提高，但术后仍面临慢性排斥反应、长期使用免疫抑制剂带来的肾功能损害、感染、肿瘤、代谢并发症等风险。诱导移植术后免疫耐受是解决这一问题的根本方法。肝脏作为免疫特惠器官，较其他脏器更容易实现免疫耐受。器官移植术后主动诱导免疫耐受的方案主要包括联合骨髓移植诱导同种异基因嵌合体、受者术前T淋巴细胞清除、阻断共刺激通路、过继输注免疫抑制细胞等［1］。其中，调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）由于其免疫抑制特性成为研究的热点，但常规Treg在作用时效、作用部位、多克隆Treg 细胞的迁移等方面均存在一定的局限性［2］。研究认为，供体特异性调节性T细胞（donor specific regulatory T cell，DSTreg）可诱导移植术后受者产生针对供体抗原的特异性耐受，不服用免疫抑制剂而长期维持移植物功能正常［3］。而胸腺移植是产生并维持DSTreg细胞长期生存的有效途径［4］。现就DSTreg 细胞在免疫耐受中的作用与意义进行综述。

1 Treg细胞的特性及其在排斥反应中的作用

Treg细胞是一类具有强大免疫抑制功能的T细胞亚群，其特性主要是免疫低反应性和免疫抑制。Treg细胞的免疫抑制作用是维持机体稳态的重要因素之一，其表达异常可引起多种自身免疫性疾病。Treg 细胞主要在胸腺与外周淋巴器官中发育，通常将其分为两类，即胸腺来源的Treg细胞（nature Treg，nTreg）与在外周诱导生成的Treg细胞（induced Treg，iTreg）。nTreg 细胞与iTreg 细胞在功能上存在一定的差异，前者被认为是免疫抑制能力较强的Treg 细胞亚群，在体内维持免疫耐受中起根本性作用［5-6］，而iTreg细胞在外周诱导产生后功能受损，会失去调节免疫耐受的能力［7］。叉头翼状螺旋转录因子（forkhead/winged helix transcription factor p3，Foxp3）是CD4+Treg 细胞分化、发育、保持功能稳定的重要因子，也是其最重要的鉴别标志物。小鼠中区分nTreg 和iTreg 的标志物是神经纤毛蛋白1（neuropilin-1，Nrp1）［8］，而在人体内则是Treg细胞特异性脱甲基区域（treg-specific demethylated region，TSDR）［9］。

Treg细胞与移植后排斥反应密切相关。研究显示，儿童肝移植患者在发生急性排斥反应时，外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例降低，在抗排斥治疗后进一步下降，1 周后仍不能恢复正常［10］。其在成人患者中亦有相似表达，且伴有Treg 细胞相关细胞因子的变化［11］。Zhou 等［12］利用大鼠肝移植模型发现，急性排斥反应中Treg 细胞及其相应细胞因子白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）显著降低。

2 Treg细胞诱导移植术后免疫耐受

基于Treg 细胞的免疫抑制特性，其抑制排斥反应、诱导免疫耐受的作用相继被证实。研究显示，在停用免疫抑制剂5年以上的肝移植患者中，移植肝组织中 Treg 细胞比例明显增加［13］。Chandran 等［14］将Treg 细胞在体外培养、扩增后输注于肾移植患者体内，输注过程安全，在降低免疫抑制剂的情况下，移植物仅存在轻度的炎症反应。但后续的研究表明，多克隆Treg细胞诱导免疫耐受亦存在较多问题。细胞过继输注中所需的Treg 细胞数量巨大，而培养后的Treg细胞纯度低且稳定性差、体内存活期短，输注后还可导致受体免疫受限，进而引发感染［15-16］。另有研究通过小鼠肝移植模型推算，小鼠体内的Treg 细胞至少要增加33%才可达到预期的治疗效果［17］。在一项脐带血Treg细胞预防移植物抗宿主病的研究中，输注的Treg细胞在体内很快衰竭，半衰期大约在20 d 左右，且Treg 细胞衰减的程度与输注的剂量无关［18］。同时，Treg 细胞也受免疫抑制药物的影响，这也进一步限制了其临床应用。在成人肝移植患者中，他克莫司对Treg 细胞存在明显的抑制作用，且这种作用与他克莫司浓度有关，高浓度他克莫司对 Treg 细胞的抑制作用更强［19］。针对 Treg 细胞在免疫诱导中存在的诸多不足，研究者相继采取了很多方法以提高Treg 细胞的分化比例，稳定扩增后的表型与抑制功能。Hajkova等［20］研究发现，在细胞培养中加用雷帕霉素可以显著提升体外培养体系中Foxp3的表达水平。另有研究认为，增加TGF-β、IL-2 等细胞因子可以促进Treg 细胞的分化、修复其调节功能［21］；使用骨髓间充质干细胞还可以诱导幼稚T细胞向Treg细胞分化［22］。尽管上述方案可以在很大程度上增强Treg 细胞的分化与功能，但缺乏对供体抗原的特异性抑制，从而使其数量仍无法达到有效诱导免疫耐受的目的。因此，有研究认为只有足够数量的Treg细胞到达移植物和局部淋巴结等炎症反应部位，才可有效抑制效应细胞的作用［23］。

3 DSTreg细胞具有更强的免疫抑制功能

DSTreg 细胞可以特异性作用于供体效应细胞，仅用少量的细胞就可以达到抑制排斥反应、诱导免疫耐受的目的。在实体器官移植中已经证实，DSTreg 细胞比多克隆Treg 细胞在抗排斥反应中更有潜力［24］。在小鼠心脏移植模型中发现，持续使用西罗莫司、环孢霉素、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associat-ed antigen 4，CTLA4-Ig）等药物并不会促进DSTreg 细胞的扩增，只是抑制常规T 细胞的扩增，而排斥或耐受的效果与移植物中积聚的DSTreg 细胞的比例有关［25］。Todo等［26］在CD80/CD86单克隆抗体存在的情况下，将成人亲体肝移植受者的淋巴细胞与经过照射的供者细胞进行共培养，产生DSTreg 细胞，在肝移植术后早期将培养后的细胞输注至受者体内诱导免疫耐受，随访16～33个月，10例患者中7例完全停用免疫抑制剂，其中4例停药超过24个月。

获得DSTreg细胞的传统方法是在伴有T细胞受体（T cell receptor，TCR）的环境下，将Treg 细胞与抗原呈递细胞、特定抗原一起培养。Mathew等［27］利用可溶性CD40L激活供体B细胞与受者Treg细胞共培养，得到了纯度较高的 DSTreg 细胞。Monti 等［28］认为雷帕霉素不仅对常规Treg 细胞有促进作用，而且可以促进 DSTreg 细胞的增殖。Ratnasothy 等［29］研究发现，IL-2可明显提高DSTreg细胞抑制排斥反应的效果，延长移植物存活时间。不仅如此，耐受模型中提取的DSTreg 细胞在输注给同种移植受体后亦具备特异性免疫抑制功能［30-31］。然而，Kotsiou 等［32］研究认为，DSTreg 细胞在培养扩增后表型与抑制功能不变，但会丧失部分趋化功能。因此，利用这些方法得到的供体抗原特异性Treg 细胞在体外扩增后，大部分会失去抗原特异性，作用有限。

4 T细胞受体的Treg细胞（T cell receptor Treg，TCR-Treg）与嵌合抗原受体Treg细胞（chimeric antigen receptor Treg，CAR-Treg）

为了克服传统培养的DSTreg 细胞的不足，利用基因工程技术，通过结合TCR产生的TCR-Treg细胞可以更好地维持抗原特异性功能［33］。TCR信号对于Treg 细胞的产生、分化、抑制功能非常关键，Treg 发挥抑制功能主要依赖于TCR接触［34］。Savage等［35］利用供者B细胞激活受者Treg细胞，再结合TCR，输注于肾移植联合骨髓移植的患者，利用TCR-Treg细胞在体内增殖，成功诱发免疫耐受，而受者体内TCRTreg细胞可存活6个月。但TCR-Treg细胞受主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）的限制，难以普遍应用。研究显示，在TCRTreg 细胞的基础上，将供体MHC 与Treg 细胞结合，得到CAR-Treg细胞，相比于多克隆Treg细胞，CARTreg细胞抑制能力更强，且可以弥补TCR-Treg细胞的MHC相容性的问题［36-37］。Zhang等［38］认为，CARTreg细胞对IL-2的依赖较TCR-Treg细胞小，可以维持稳定的表型和功能，更容易迁移至靶器官。Noyan等［39］研究中，CAR-Treg 细胞展示了比 nTreg 细胞更强的抑制功能，无论在体外还是在人源化小鼠模型中均可抑制免疫排斥反应。但CAR-Treg 细胞的不足是输注后有可能引起细胞因子“风暴”和神经系统毒性，另外靶标抗原的选择、特异性抗体的产生难度较大，容易出现 CAR-Treg 细胞衰竭［38］。UniCARTreg 细胞作为新一代技术产物，可在一定程度上消除MHC 的限制与 TCR 的影响，提高移植安全性［40］，但其在临床中的实际效果有待进一步研究。

5 胸腺在DSTreg细胞产生中的作用与胸腺移植在诱导移植免疫耐受中的作用

在儿童时期，胸腺是一个高度强大的免疫器官，是T细胞发育、成熟的场所，对于诱导供体特异性耐受非常关键。胸腺Treg 细胞由2 部分组成，一部分是由CD4 单阳性胸腺细胞新生成的Treg 细胞，另一部分是进入胸腺再循环的外周Treg细胞。在人类和小鼠中，nTreg细胞几乎全部依赖于胸腺产生。儿童胸腺中的Treg细胞非常丰富，1 g胸腺组织所含Treg细胞大约是1 mL，是外周血的500倍，而且在扩增后功能稳定［41］。新生儿胸腺的微解剖屏障对外来细胞的限制没有成人胸腺那么严格，更容易产生DSTreg细胞；新生儿胸腺通过消耗进入胸腺的效应T细胞，提高诱导中枢免疫耐受的效果。DSTreg细胞的产生主要是通过胸腺中的抗原呈递细胞来完成，包括胸腺树突细胞和胸腺髓质上皮细胞。在现阶段的移植模型中，胸腺产生供体抗原特异性Treg 细胞主要有2种方式，一种是供体胸腺（组织）移植，另一种为向受体的胸腺中注射供体抗原。

在临床上，胸腺移植主要用于治疗儿童先天性胸腺缺如或胸腺切除所继发的免疫缺陷性疾病，如DiGeorge 综合征等。在移植领域，胸腺移植主要在儿童心脏移植的病例中开展［42］。在基础研究中，除免疫缺陷病以外，胸腺移植的研究主要涉及供体特异性T 细胞。在一项小鼠胸腺移植的研究中，受体体内供者来源的CD3+T细胞的总数在移植术后前4周内升高，而后开始下降；进入胸腺再循环的初始型CD4+T 细胞的生存期较短，而此时移植物内的胸腺细胞的数量已达到正常小鼠的水平［43］。Yamada等［44］认为在异种移植中，同时行胸腺移植可以产生抗原特异性T 细胞，延长移植物存活时间，但在猪、犬等大动物模型中，所移植的胸腺需要血管重建。Cooper等［45］认为尽管胸腺移植产生的供体抗原特异性T 细胞可延长移植物存活时间，有助于诱导免疫耐受，但由于其有作用时间并非终生、细胞比例偏低等问题，尚不足以实现长期、完全停用免疫抑制剂。

6 结语

随着手术技术的成熟，器官移植的关注点逐步转移到提高移植受者的生存质量与远期存活率，实现免疫耐受是器官移植在挽救患者生命的同时所达到的最理想状态。DSTreg细胞可保持免疫抑制的抗原特异性，而胸腺移植可维持抗原特异性免疫抑制的持久性，二者的结合或可为今后肝移植提供诱导免疫耐受的新策略。