新疆特色果蔬中乳酸菌分离鉴定及其抑菌活性

孙海龙， 李佳益， 张 敏， 曾傲琼， 倪永清*

（1.石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

长期研究发现，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少，且在人体中具有重要生理功能的有益菌，它们在人类肠道中起着很大生理作用。这些有益菌拥有抗酸和胆汁、粘附人类上皮细胞、在人类肠道中繁殖、产生有机酸、细菌素等抗菌物质的特性。

以乳酸菌为生物保鲜剂用于果蔬和肉制品的保鲜已有不少报道[1-2]。Martinez等[3]将Lactobacillus plantarum菌液喷涂于荔枝、红毛丹果实表皮，发现能够降低致病菌的数量，同时还能抑制其褐变保持果皮的色泽、降低水分损失，延长果实货架期。果蔬富含矿物质、维生素、膳食纤维和抗氧化剂等有益的营养物质，且没有限制少数特定群体消费的乳品过敏原，因此使得果蔬成为传递益生菌的理想载体[4]。Raffaello等以卷心菜为原料[5]，将 Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、Lactobacillus delbrueckii加入灭菌的未添加其他营养物质的卷心菜汁里，乳酸菌能快速繁殖，30℃发酵48 h后，细胞数量高达108cfu/mL，且Lactobacillus.plantarum、Lactobacillus.delbrueckii比Lactobacillus.casei能产生更多的可滴定酸。

由于易受到快速腐败微生物及一些病原体污染，新鲜的水果和蔬菜保质期较短，很容易腐烂变质。巴氏灭菌以及添加化学防腐剂是保证果蔬安全的主要技术操作，但同时也会带来如物理特性、化学成分变化等不理想的改变[6]。为避免这些缺陷，利用产细菌素等抗菌物质的乳酸菌，开发果蔬汁益生菌功能饮料以及作为天然抗菌防腐剂应用于果蔬贮藏保鲜等新技术备受关注[5，7-9]。具有产细菌素能力的乳酸菌对不同食物腐败或病原菌都表现出一定的抑制能力，且具有安全、无残留、抗菌谱广等优势，这类产细菌素的乳酸菌在乳品加工、果蔬加工、水产品、肉制品等领域的应用已经取得显著成果[10-12]。许多研究已经证明[3，5-6，13-14]，添加产细菌素的乳酸菌到食品中比直接添加细菌素更可取。作为一类天然的、安全的食品抗菌防腐剂，乳酸菌可以较好地抑制致病菌及腐败菌的生长，从而保证食品的质量，提高食品的安全性；这使得乳酸菌作为抗菌防腐剂在食品保鲜技术中的优势日渐凸显，在未来天然食品生物防腐剂研究与开发中有极大的应用潜力。

新疆盛产瓜果、蔬菜，且营养高、口感好。由于新疆特殊的地理环境及气候多变性，较好地保存了当地自然环境中的有益微生物，是乳酸菌的天然储存库。对新疆不同地区水果中乳酸菌进行分离、鉴定及生物学特性研究，筛选出具有抑菌活性的乳酸菌，为进一步开发果蔬汁益生菌功能饮料及加速天然食品防腐剂在食品保鲜中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从新疆不同地区（伊犁、塔城、喀什、石河子等地）用提前灭菌的工具采集野生沙棘、沙枣、苹果、海棠果、山楂、石榴、葡萄、库尔勒香梨等样品（每种取样2～3份），装入提前灭菌的保鲜盒内，贴上标签后放置于车载冰箱-4℃冷藏，当天运回实验室。样品立即在无菌条件下处理，将其表皮用灭菌刀具削下放入装有30 mL MRS液体培养基的锥形瓶中，30℃摇床振荡培养12 h，4℃保藏备用。

1.2 主要试剂和仪器

用于PCR扩增的全套试剂均购自TaKaRa公司。所用培养基及相关药品均购自海博生物技术有限公司。生理生化试验所用试剂购自天津市巴斯夫化学试剂厂。PCR仪为德国Biometra公司的Tprofessional；凝胶成像仪为美国BioRad公司Gel DOC XR；水平电泳仪为美国BioRad公司的PowerPac Universal。

1.3 菌株分离纯化

采用梯度稀释平板涂布法分离样品中的乳酸菌。取 10-2、10-3、10-43 个梯度稀释样品 150 μL 分别涂布于MRS、Elliker、M17、乳酸杆菌选择性琼脂4种固体培养基上，一式两份，37℃厌氧培养2 d。待菌落长出后挑取单菌落，划线培养3次后，将所得纯培养物转接到MRS液体培养基[15]。菌株的细胞形态、菌落形态、生理生化实验参照文献进行[16]，通过革兰氏染色和接触酶实验进行初筛，初步确定疑似乳酸菌。

1.4 菌株rep-PCR指纹图谱分析

采用CTAB法提取菌株单菌落DNA。用引物GTG5 （5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′） 对分离菌株DNA进行PCR扩增[17-18]。反应在25 μL体系中进行， 包括 2×PCR Master Mix 12.5 μL，0.5 μmol/L MgCl22.0 μL， 引物 1 μL，2 μL 的模板以及 7.5 μL的ddH2O。扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；40℃退火 30 s；65 ℃延伸 8 min；32 个循环；72℃终延伸16 min。PCR结束后，扩增产物经质量浓度为14 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测2 h。在紫外凝胶成像仪中观察电泳结果，DNA带型完全一致的菌株被认为属于同一物种，从中选取表菌株作进一步16S rRNA基因测序分析。

1.5 16S rRNA基因测序及系统发育分析

用引物 27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对菌株进行16S rRNA基因扩增[17，19]。扩增条件：94℃预变性 4 min，94℃变性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃终延伸10 min。PCR扩增产物经纯化后送至上海生工生物技术有限公司测序，将所得序列提交到GenBank数据库中，利用BLAST进行序列同源性分析，比较供试菌株与已知乳酸菌相应序列的相似性。在MEGA 6.0软件中用p-distances和Kimura-2parameter双参数法构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验[20]。

1.6 牛津杯法筛选具有抑菌活性的乳酸菌

分别吸取100 μL指示菌 （金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、单增李斯特菌 Listeria monocytogenes）稀释液（活菌数达到2.0×108cfu/mL）涂布于已凝固的LB固体培养基，用灭菌棉签均匀涂抹，在每个平板中等距放置4个牛津杯，再分别加入200 μL的乳酸菌上清液，用未加菌液的培养基为空白对照[21]。放置于4℃冰箱中扩散5 h后，在37℃培养箱中培养16 h。若在牛津杯周围出现抑菌圈，则表示该菌株可以产细菌素，具有抑菌活性；用游标卡尺测量抑菌圈直径，每株菌做3个平行，求平均值。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌生理生化鉴定

从沙棘、沙枣、苹果、海棠果、山楂、葡萄、红枣等样品中共分离得到纯培养物137株。通过革兰氏、接触酶实验初步确定疑似乳酸菌共90株。如图1所示，菌株菌落形态大多为白色或乳白色，边缘整齐，直径在0.5～2 mm之间，表面较湿润，易于挑起。90株植物菌株中有32株菌落颜色呈白色，36株菌落颜色呈乳白色，17株菌落颜色呈淡黄色；透明或半透明状4株，淡灰色1株。镜检发现，大多数分离菌株细胞形态呈杆状或球状。

图1 乳酸菌菌落形态及其细胞形态Fig.1 Colonies and cell morphology of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌16S rRNA基因序列鉴定及其系统发育

DNA带型完全一致的菌株通常被认为属于同一物种。对90株疑似乳酸菌通过rep-PCR指纹图谱表征分析，显示出15种不同的DNA带型。结合表性特征及指纹图谱结果，选取15株代表菌株进行16S rRNA基因扩增及测序分析。

将测序得到的序列提交到NCBI，在GenBank数据库中利用BLAST在线工具与已知的16S rRNA基因序列进行同源性比对，选取相似度最高的序列，分析其亲缘关系并建立系统发育树。结果如表1所示，16S rRNA鉴定结果表明分离菌株主要隶属于乳杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属 Leuconostoc）和乳球菌属（Lactococcus）3个属。其中Lactobacillus 6株， 包括 Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillusplantarum 5 个 种 ；Leuconostoc 8株，包括Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc pseudomesenteroides、Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicum 3个种；而Lactococcus只分离到一株B-11-5，属于Lactococcus lactis。

由系统发育树可知（图2），被测菌株16S rRNA基因序列与GenBank数据库中同源性相似性在98%～100%之间。 M-PC-4、M-PC-12、M-PC-15、MPC-17、M-PC-18、M-PC-19 聚为一群，均属于乳杆菌属（Lactobacillus）；其中 M-PC-4 与 Lactobacillus plantarum，M-PC-12 、M-PC-19 与 Lactobacillus alimentarius，M -PC -17 与 Lactobacillus paralimentarius，M-PC-18 与 Lactobacillus kimchii的相似度均达到了100%；M-PC-15与Lactobacillus paraplantarum的相似度达到了99%，因此它们均隶属于乳杆菌属（Lactobacillus）。M-5-1、E-5-7、M-6-3、B-5-12、M-11-13、M-11-13 与 Leuconostoc mesenteroides的相似度为99%～100%之间，M-5-6、E-5-8与Leuconostoc pseudomesenteroides的相似度为100%，可以确定属于明串珠菌属（Leuconostoc）。 而 B-11-5 与 Lactococcus lactis的相似度为100%，在系统发育树上形成一个单独分支。

表1 乳酸菌鉴定及表型特征Table 1 Identification and phenotypic characteristics of Lactic acid bacteria

2.3 具有抑菌活性乳酸菌的筛选

乳酸菌通常能够抑制与其种属相近的菌株，利用15株已鉴定的乳酸菌作为目标菌，分别以金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特氏菌作为指示菌筛选具有抑菌活性的菌株。结果显示分别来自Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus.alimentarius、Lactobacillus. paraplantarum、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis 5个种的乳酸菌具有抑制指示菌生长的能力。不同乳酸菌所产生的抑菌圈直径在8～20 mm范围内 （牛津杯直径为7 mm）；抑菌效果由表2可知，不同种乳酸菌对不同指示菌的抑菌程度不同，如图3所示。

图2 基于16S rRNA序列的菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of the 16S rRNA gene

表2 对指示菌抑菌活性Table 2 Antibacterial spectrum for indicator bacteria

图3 产细菌素乳酸菌的筛选Fig.3 Screening for bacteriocin-producing strains

3 结语

本研究利用4种培养基对8种新疆不同地区水果表皮可培养乳酸菌分离进行了分离纯化。16S rDNA序列分析确定15株代表菌株分别隶属于乳杆菌属、明串珠菌属和乳球菌属3个属，共8个种。抑菌研究结果表明，Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis 5个种的8株乳酸菌对不同指示菌在一定程度上都有抑制作用，不同种乳酸菌对不同指示菌的抑菌程度不同。

本研究从不同水果中分离所得乳酸菌主要是Leuconostoc和 Lactobacillus， 尤 其 Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus plantarum是水果表皮的优势菌群，并且以其作为生物保鲜剂用于果蔬贮藏保鲜已有不少报道[1-3，5，7-8，14]。 明串珠菌和乳杆菌属菌株多数都能抑制金黄色葡萄球菌和李斯特菌的生长，但对枯草芽孢杆菌的抑菌效果并不明显。目前，Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus delbrueckii、Lactococcus lactis 是 果 蔬乳酸发酵中最常见的菌种[1，5，22]。 有研究指出[6，22]，乳酸发酵过程中，当果蔬汁作为唯一的发酵底物时，由于葡聚糖蔗糖酶的合成，明串珠菌可选择性地促进一些乳杆菌和双歧杆菌的生长，从而平衡肠道微生物组成。Raffaella等通过 Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、Lactobacillus delbrueckii等研究了番茄汁是否适合生产益生菌产品，结果表明，4种乳酸菌都能在没有调节番茄汁PH和补充营养物质的情况下，快速繁殖并产酸。且在4℃冷藏4周后，L.plantarum、L.delbrueckii依然能在低pH、高酸度条件下生存[5-6]。L.plantarum具有较广的抑菌普，能抑制多种致病菌的生长。Martinez等[3]用L.plantarum菌液喷涂荔枝，并在10℃条件下贮藏，延缓了果皮褐变。李转羽等[6，23]研究发现，除金黄色葡萄球菌、李斯特菌等革兰氏阳性菌外，L.plantarum对沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌也有明显抑制作用。

本研究前期对新疆不同地区水果中的乳酸菌进行了分离鉴定，并对具有抑菌活性的乳酸菌进行了初步筛选。后续研究中，会对分离菌株的生长特性及抑菌能力进行拓展实验，以期更加准确地了解其抑菌活性及相关抑菌物质的功能性质。为进一步开发果蔬汁益生菌功能饮料及加速天然食品防腐剂在食品保鲜中的应用奠定基础。