明日叶中4-羟基德里辛和黄色当归醇的提取纯化及鉴定

王 磊， 张连富

（江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

明日叶（Angelica keiskei），是伞形科多年生草本植物，可药食两用[1]。嫩茎和叶可作为蔬菜用于炒、炸、凉拌或做汤，而全植物可入药。研究表明，明日叶含有人体所需要的多种矿物质、氨基酸、维生素以及微量元素，是一种营养较全面、均衡的蔬菜[2]。此外明日叶还含有查尔酮类、香豆素类、类黄酮类、天然有机锗等天然功能性成分[3]，具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、改善睡眠、提高免疫力等保健功能[4]。均衡全面的营养以及优良的保健作用，赋予了明日叶很大的利用价值，以明日叶为原料开发出的产品也多种多样，有保健茶[5]、保健酒[6]、固体饮料[7]、保健胶囊[8]、咀嚼片[9]、营养保健面条[10]、黑番茄酱[11]等。

其中 4-羟基德里辛（4-Hydroxyderricin，4-HD）和黄色当归醇（Xanthoangelol，XAG）是明日叶中主要的功能性保健成分[12]。因此为了更好地开发和利用4-HD、XAG、明日叶及其相关的产品，需要对4-HD和 XAG进行深入的研究探讨。然而，近年来对明日叶的研究主要集中在4-HD和XAG的功能保健作用上，明日叶中4-HD和XAG的提取工艺尚未见报道。因此本文以明日叶为原料，以4-HD和XAG的得率为评价指标，研究提取工艺参数（提取溶剂、温度、时间、次数以及料液比）对提取得率的影响。在此基础之上，采用正交试验法优化提取工艺。此外，本文还采用硅胶柱层析和半制备高效液相分离纯化得到高纯度的4-HD和XAG，并通过液质联用仪（HPLC-MS）及核磁共振仪（NMR）对 4-HD及XAG的分子结构及纯度进行鉴定。为4-HD、XAG及明日叶的利用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

明日叶根：江苏百代兰花股份有限公司；硅胶（200～300目）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；液相甲醇：色谱纯，百灵威科技有限公司。

Waters1525液 相 色 谱 仪 （PDA检 测 器Waters2998，自动进样器 Waters2707）：美国 Waters公司；Aduance III 400 MHz核磁共振波谱仪：德国布鲁克AXS有限公司；MALDI SYNAPT MS液相色谱串联质谱联用仪：美国Waters公司；Waters1525半制备高效液相色谱仪 （PDA检测器Waters 2998和自动进样器 Waters 2707）：美国 Waters公司；CHRIST冷冻干燥机 ALPHA1-2LD PLUS：德国Marin Christ公司；RV06-ML1B旋转蒸发仪 （倾斜式）：德国 IKA。

1.2 4-HD和XAG含量的测定

1.2.1 混合标准溶液配置 精确称取4-HD和XAG各5.0 mg，用甲醇溶解并定容于5 mL容量瓶中，得质量浓度为1 mg/mL的混合对照品储备液。按梯度稀释成质量浓度分别为 0.6、0.3、0.15、0.12、0.09、0.06及0.03 mg/mL的混合标准溶液。

1.2.2 HPLC色谱条件 色谱柱Phenomenex（C18，4.6 mm×l50 mm，5 μm）；柱温 30 ℃；流动相甲醇∶水=8∶2；流速 1 mL/min，进样量 20 μL；检测波长330 nm[13]。

1.3 4-HD和XAG提取条件优化

1.3.1 原料的预处理 新鲜的明日叶根，清水洗涤，除去泥土等杂质，于50℃的电热恒温鼓风干燥箱中干燥，粉碎过60目筛，备用。

1.3.2 提取试剂的选择 准确称取5.0 g明日叶根粉于圆底烧瓶中，置于水浴锅中提取，研究提取试剂（乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇和水）对4-HD和XAG提取得率的影响。

1.3.3 提取单因素试验 准确称取5.0 g明日叶根粉于圆底烧瓶中，置于水浴锅中回流提取，研究乙醇体积分数、温度、时间、料液比和提取次数对4-HD和XAG提取得率的影响。粗提液旋转蒸发除去溶剂后，冷冻干燥。将冻干的粗提物用甲醇定容于250 mL的容量瓶中，HPLC分析，以4-HD和XAG的得率为评价指标，确定提取工艺条件。

1.3.4 正交试验设计 以上讨论了各单因素的影响，但实际操作中各因素相互交叉影响。根据单因素试验结果，选取影响较大的水平进行正交试验，以确定最佳提取条件。

采用 L9（34）正交表，以提取温度（A）、乙醇体积分数（B）、料液比（C）、 提取时间（D）作为 4 个考察因素，选取其最佳条件范围内的3个水平进行试验。正交设计试验因素水平见表1。

1.4 4-HD和XAG的纯化

称取明日叶根粉50 g，在最佳条件（料液比1∶10、80%乙醇、提取温度55℃、提取时间90 min、提取2次）下进行试验，收集粗提液，减压浓缩得到深黄绿色浸膏。

表1 试验设计因素水平表Table 1 Actors and levels of orthogonal test

往浸膏中加入200 mL去离子水，使其充分溶解，用2倍体积乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩除去乙酸乙酯，得到萃取液浸膏。

浸膏用少量的洗脱剂 （正己烷∶乙酸乙酯=3∶7）溶解，上样硅胶柱。调节硅胶柱层析的洗脱速度，使其每秒钟流出1～2滴，每5 min接一管。流出液经HPLC-MS检测，分别合并含有4-HD和XAG的组分流出液。减压浓缩除去洗脱剂，得到硅胶柱层析样品。

用半制备高效液相纯化硅胶柱层析样品。色谱条件如下：半制备 C18柱（10 mm×250 mm，5 μm）；柱温 30 ℃；流动相甲醇∶水=8∶2；流速 4 mL/min，进样量1 mL；检测波长330 nm。根据出峰情况分别收集相应组分的流出液。减压浓缩除去甲醇后冷冻干燥。

1.5 4-HD和XAG的鉴定

对冷冻干燥的样品进行HPLC-MS及NMR鉴定。其中 HPLC-MS的条件为 CSHC18（2.1mm×100mm，1.7 μm）；流动相甲醇∶水=8∶2；柱温：30 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL。质谱条件为离子方式：ESI；毛细管电压：3.0 kV；锥孔电压：30 V；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流速：500 L/h；锥孔气流速度：50 L/h；碰撞能量（eV）：6 V；质量范围：100～1 500 m/z；检测器电压：1 800 V。样品溶于CDCl3。四甲基硅烷作为化学位移标准品。

2 结果与分析

2.1 4-HD和XAG的混合标准曲线

根据HPLC结果可以得出4-HD和XAG的质量浓度X （μg/mL）与峰面积Y的线性关系拟合标准曲线公式分别为：Y=69 398.19X+136 486.68（R2=0.999 6）、Y=85 102.85X+138 820.79 （R2=0.999 1），线性范围为0.03～1 mg/mL。混合标准品与样品的高效液相色谱图如图1所示。

图1 混合标准品及明日叶根粗提液的HPLC色谱图Fig.1 HPLC analysis of mixed standard samples and crude extract sample solution

2.2 4-HD和XAG提取条件优化

2.2.1 提取试剂的选择 试验结果如图2所示。从图中看出，提取试剂对4-HD与XAG得率的影响是一致的。这可能是由于两种物质具有相似的结构，相似的极性[14]。但不同溶剂对这两种物质的提取效果差异显著，乙醇和丙酮的效果较好，甲醇、乙酸乙酯、乙醚次之，水的提取效果最差。这可能是因为乙醇和丙酮的渗透性较大，且与4-HD与XAG的极性较相似，所以乙醇和丙酮的提取效果较好。但是丙酮毒性及挥发性较大，而乙醇较安全，故选择乙醇作为提取溶剂。

图2 提取试剂对4-HD和XAG得率的影响Fig.2 Effect of solvent on 4-HD and XAG yield

2.2.2 提取温度对提取效果的影响 由图3看出，随着温度上升，两个物质得率逐渐增大，当温度达到55℃时，这两物质提取效果最佳。当温度高于55℃时，这两物质得率逐渐下降。4-HD和XAG的提取属于固-液间进行物质传递的过程。体系的温度会影响到原料微粒在溶剂中的运动特性。温度低时溶剂分子运动慢，不能很好地溶解出4-HD和XAG，温度升高4-HD和XAG溶出量增加，提取量增大；但对4-HD和XAG的稳定性研究表明，当环境温度过高时，4-HD和XAG等查尔酮化合物会不可避免地降解[15]。当两者的作用达到平衡时提取量将不再增加，但当后者的作用占主导地位时提取量就会降低。故提取温度应选择55℃左右为宜。

图3 提取温度对4-HD和XAG得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on 4-HD and XAG yield

2.2.3 乙醇体积分数对提取效果的影响 由图4可知，以乙醇为提取溶剂，体积分数在60%～80%范围内，得率随乙醇体积分数的增加而增大，80%乙醇溶液的提取效果最好。80%～100%范围内，得率随乙醇体积分数的增加而减小。4-HD和XAG均含有酚羟基，在植物体内会与蛋白质、多糖等以氢键及疏水键形式结合，而有机试剂具有断裂氢键的作用。但是纯的有机试剂不足以破坏氢键，故可采用有机试剂和水的复合体系作为提取溶剂。但是4-HD和XAG的极性较低，由“相似相溶”原理知，当提取剂中水的比例过高，使得提取剂极性偏大时，得率会下降。所以乙醇体积分数应选择80%左右为宜。

2.2.4 料液比对提取效果的影响 料液比增大，传质动力增加，使原料中更多目标物质进入到溶液中[16]。当浸提剂用量增加到一定程度，传质达到平衡后，再增加溶剂用量，4-HD和XAG的溶出总量不再增加，而仅仅是更加均匀地分布在溶剂中。考虑到成本，料液比应选择1∶10左右为宜（图5）。

图4 乙醇体积分数对4-HD和XAG提取效果的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on 4-HD and XAG yield

图5 料液比对4-HD和XAG提取效果的影响Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on 4-HD and XAG yield

2.2.5 提取时间对提取效果的影响 由图6可知，随着提取时间的延长，得率先增高，后略微下降。在90 min时，两物质得率达到最大。提取的传质过程要有足够的时间达到平衡，时间太短，提取还没有达到平衡，提取量就较低；但是如果提取时间过长，4-HD和XAG在较高温长时间作用下会受到破坏。故提取时间应选择90 min左右为宜。

图6 提取时间对4-HD和XAG提取效果的影响Fig.6 Effect of extraction time on 4-HD and XAG yield

2.2.6 提取次数对提取效果的影响 从图7可以看出，对4-HD第1次和第2次提取量分别占总提取量的75.21%和22.87%，第3次及第4次提取量分别占总提取量的1.69%和0.23%。对XAG第1次和第2次提取量分别占总提取量的77.80%和19.81%，第3次及第4次提取量分别占总提取量的1.78%和0.61%。总的来说，4-HD和XAG前两次的提取量分别已达到总提取量的98.08%及97.61%。提取的次数越多，目标产物得率也越多，但同时提取剂消耗量也越多。故提取次数应选择提取2次为宜。

图7 提取次数对4-HD和XAG提取效果的影响Fig.7 Effect of times of extraction on 4-HD and XAG yield

2.2.7 正交试验结果与分析 由单因素试验得，各因素对4-HD与XAG得率的影响是一致的，所以为了方便，在正交试验中只需考察各因素对4-HD得率的影响情况。正交试验设计及结果如表2所示。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal test and results

根据表2中K值可知，最佳提取工艺为A2B2C1D2，即提取温度55℃，乙醇体积分数80%，料液比1∶10，提取时间90 min。由极差R的大小，可判断出影响得率的因素顺序依次为B＞A＞D＞C，即乙醇体积分数＞提取温度＞提取时间＞料液比。

2.2.8 验证试验 按提取温度55℃，80%乙醇，料液比 1∶10，提取时间90 min，提取2次进行3次平行试验，4-HD得率均值为1.82 mg/g，XAG得率均值为2.12 mg/g，高于表2每一项试验结果，故A2B2C1D2为最佳提取工艺。

2.3 4-HD和XAG的纯化

50 g明日叶根粉在最优条件下提取，粗提液冷冻干燥得到13.79 g粗提物，经测定，其中含有91 mg 4-HD、106 mg XAG。考虑到4-HD和XAG极性较低，经乙酸乙酯萃取可进入到乙酸乙酯相中[13]，籍此可以初步除去极性较强的杂质，如类黄酮、极性色素、多糖、无机离子等。减压浓缩除去乙酸乙酯，得到1.03 g萃取物。经萃取后，4-HD的纯度由粗提取中的0.66%提高到8.83%；XAG的纯度由0.77%提高到10.29%。

萃取物过硅胶柱层析，经洗脱剂（正己烷∶乙酸乙酯=3∶7）洗脱，用HPLC-MS检测各收集管4-HD和XAG。结果表明，34-41管主要含有4-HD，50-75管主要含有XAG组分（如图8所示），纯度分别为70.63%和67.94%。合并洗脱组分，浓缩除去洗脱剂，得到硅胶柱层析样品。

图8 萃取物经硅胶柱层析洗脱HPLC谱图Fig.8 HPLC analysis of different fractions purified by silica gel column chromatography

硅胶柱层析样品用半制备高效液相进行纯化。根据出峰情况分别收集相应组分的流出液，分别在22.306和 28.202 min收集到化合物1和化合物2。减压浓缩除去收集液中的甲醇后冷冻干燥。

2.4 4-HD和XAG的鉴定

对用制备型高效液相纯化得到的化合物1和化合物2进行HPLC-MS及NMR结构及纯度鉴定。质谱图如图9所示。

图9 化合物1和化合物2的ESI-MS图谱Fig.9 Results of ESI-MS chromatogram of compound 1 and 2

化合物 1质谱数据（图 9（a）），碎片 m/z 337.152 8是[M-H]-分子离子峰，338.1613是母离子峰，所以其分子量为338。化合物2质谱数据（图9（b）），碎片m/z 391.199 8是[M-H]-分子离子峰，392.205 7是母离子峰，所以化合物2的分子质量为392。

化合物 1 的 NMR 数据：1H-NMR δ1.71（3H，s，H-5″），1.82 （3H，s，H-4″），3.41 （2H，d，3J（H，H） =7.13 Hz，H-1″），3.93 （3H，s，4′-OCH3），5.26（1H，m，3J（H，H） =7.16 Hz，H-2″），6.52（1H，d，3J（H，H） =9.12 Hz，H-5′） 6.90（2H，d，3J（H，H） =8.44 Hz，H-3，5），7.48（1H，d，3J（H，H） =15.45 Hz，H-α），7.56（2H，d，3J （H，H） =8.35 Hz，H-2，6），7.81（1H，d，3J（H，H） =9.29 Hz，H-6′），7.84（1H，d，3J（H，H）=16.60 Hz，H-β），13.48 （1H，s，2′-OH）。13C-NMR δ 17.84 （C-4″），21.75 （C-1″） 25.81 （C-5″），55.80（OCH3），102.21（C-5′），114.67（C-1′），116.08（C-3，5），117.62（C-3′），118.08（C-α），122.05（C-4′），127.63（C-1），129.25（C-5′），130.58（C-3″），131.97（C-2，6），144.19 （C-β），158.24 （C-4），162.99 （C-2′），163.35（C-4′），192.53（C=O）。

化合物 2 的 NMR 数据：1H-NMR δ1.59（3H，s，H-9″），1.67（3H，s，H-8″），1.83（3H，s，H-10″），2.10（4H，m，H-4″，5″），3.49（2H，d，3J（H，H） =7.14 Hz，H-1″），5.06（1H，t，3J（H，H）=6.09 Hz，H-6″），5.30（1H，dd，3J （H，H） =7.20 Hz，H-2″），6.43（1H，d，3J（H，H） =8.90 Hz，H-5′），6.88 （2H，d，3J （H，H） =8.46 Hz，H-3，5），7.46（1H，d，3J（H，H） =15.44 Hz，H-α），7.57（1H，d，3J（H，H）=8.58 Hz，H-2，6），7.57（1H，d，3J （H，H） =8.90 Hz，H-6′），7.86（1H，d，3J（H，H）=15.37 Hz，H-β），13.88（1H，s，2′-OH）.13CNMR δ 16.31（C-10″），17.70（C-9″），21.81（C-1″），25.63（C-8″），26.48（C-5″），39.77（C-4″），114.20（C-1′，3′），116.11（C-3，5），118.38（C-α），121.11（C-2″），123.83 （C-6″），127.99 （C-1），129.29 （C-6′），130.56 （C-2，6），132.07 （C-7″），139.73 （C-3″），144.09（C-β），158.08（C-4），161.86（C-4′），163.95（C-2′），192.36（C=O）。

所以由此确定化合物1和化合物2的分子分别为C21H22O4、C25H28O4。结构式见图10。即化合物1为4-HD，化合物2为XAG。

图10 化合物1和化合物2的结构式Fig.10 Chemical structures of compound 1 and 2

3 结 语

本文以明日叶为原料，首次对4-羟基德里辛和黄色当归醇的提取工艺进行探讨。通过单因素以及正交试验得出4-羟基德里辛和黄色当归醇最佳提取工艺，条件为：提取次数2次、提取溶剂80%乙醇、提取温度55℃、提取时间90 min、料液比 1∶10。在此条件下，4-HD得率为1.82 mg/g，XAG得率为2.12 mg/g。这为明日叶以及4-羟基德里辛和黄色当归醇的利用奠定了基础。采用乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析以及半制备液相相结合的方法对粗提液进行纯化，经HPLC-MS及NMR分析表明，纯化得到的两种物质为4-羟基德里辛和黄色当归醇，纯度分别为99.08%和98.92%。