结核性脑膜炎患者脑脊液外泌体中Let-7b的表达水平及临床意义

路雁惠， 郭 斌， 张锐毅， 温璐璐， 吴凯敏， 李燕飞， 何谦益, 贾延劼

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为21-25 nt的小分子非编码单链RNA，可靶向与特异性mRNA结合，在转录后水平调控基因的表达，Let-7家族为目前研究较为深入的miRNA之一，当let-7在人体正常表达时，控制细胞增殖、分化、死亡，同时也参与多种神经系统疾病的发生、进展、转归[1]。外泌体是直径约为20～150 nm的脂质双分子层囊泡结构，其内富含蛋白质、脂质、核酸等物质。外泌体可以富集脑内部分miRNA，因此脑脊液中的外泌体miRNA有可能是颅内病理生理学变化的重要证据[2，3]。结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是中枢神经系统感染性疾病，由结核分枝杆菌感染引起，目前仍然是全世界最严重的传染病之一，但当前该疾病的诊断局限性严重减缓了消除结核病的步伐，结核性脑膜炎中尤为明显。有研究证实肺结核患者中let-7b和miR-30b的水平显著上调，与结核病的疾病发展有关[4]。本实验通过检测结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎、正常脑脊液中的外泌体中let-7家族各miRNA表达差异，探讨let7家族对结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎、正常对照者的鉴别作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料 从2017年1月-2018年1月在郑州大学第一附属医院神经内科就诊的住院患者中，选取15例结核性脑膜炎患者(简称结脑组)，男性6例，女性9例，平均年龄(35±10.75)岁。15例病毒性脑膜炎患者(简称病脑组),男性8例，女性7例，平均年龄(28±16.43)岁。15例正常脑脊液患者(简称对照组)，男性5例，女性10例，平均年龄(30±6.50)岁，分别收集每位患者脑脊液标本。所有被研究者有以下任一情况者均排除在本研究以外：(1)中枢神经系统急慢性炎性脱髓鞘性疾病、结缔组织病、神经系统肿瘤等引起患者脑脊液检测相关生化指标异常的神经系统疾病；(2)妊娠和哺乳期妇女；(3)不符合实验纳入标准者。本实验由郑州大学医学伦理委员审核批准，同时获得所有实验对象及其委托人同意，签署授权委托同意书和知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 脑脊液外泌体提取 患者入院后于无菌条件下行腰椎穿刺术后用普通干燥管收取患者脑脊液约5 ml，在4 ℃，500 g离心10 min，去除污染细胞及碎片等杂质，将离心后所得上清液用移液枪移至EP管中，放置于-80 ℃低温冰箱保存。采用ExoQuick Precipitation试剂盒(SBI公司)分离提取外泌体。

1.2.2 外泌体鉴别 采用透射电子显微镜观察外泌体形态：吸取外泌体悬液滴于铜网上，室温下静置30 min，再向铜网上滴加3%磷钨酸溶液，静置5 min，透射电镜下拍照；Western blot测定外泌体标志物含量：取超离得到的外泌体100 μl，加入5 μl含有1%蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA细胞裂解液(碧云天，海门，中国)，冰上裂解30 min，12000 r/min离心10min，取上清液，BCA 法蛋白定量，加入适量5×样品缓冲液后，煮沸10 min。20 μl的样品上样至15%的SDS聚丙烯凝胶中电泳，接着转印至PVDF膜，室温下用5%脱脂牛奶封闭液封闭处理1 h。加入一抗(CD63和CD9单克隆抗体),4 ℃过夜孵育，次日室温恢温30 min，回收一抗后，TBST洗涤3次,每次10 min,加入二抗,室温孵育1 h。 TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min，应用ECL法显色,在凝胶成像系统中扫描显像。

1.2.3 荧光定量PCR检测目的基因 根据Trizol法应用miRNeasy Serum/Plasma Kit 试剂盒(QIAGEN公司)，提取脑脊液miRNA及外泌体miRNA，具体步骤按说明书操作。紫外分光光度计测吸光度值确定RNA 的浓度和纯度。于PCR仪上，37 ℃，温育60 min，进行Poly(A)加尾，混匀后，在PCR仪上42 ℃，60 min；72 ℃,5 min反应结束后，冰上冷却。-20 ℃保存逆转录所得cDNA待测。常规PCR检测各基因扩增效果及荧光定量PCR检测目的基因miRNA相对表达，具体步骤如下：PCR反应条件：95 ℃，10 min预变性；然后95 ℃变性10 s，变性，接着60 ℃，复性10 s，最后72 ℃延伸30 s，循环参数40个。反应结束后，运用琼脂糖凝胶电泳法检测各个基因PCR结果。常规PCR检测靶基因扩增效果，荧光定量PCR反应条件：95 ℃，预变性10 min后；调定参数为(95 ℃，10 s；60 ℃，30 s,采集荧光)条件下，热循环40个，60 ℃～95 ℃熔解曲线。内参以U6为参考标准，每个独立样本检测3次，计算处理实验组及对照组每个样本中miRNA 的△Ct值(注：靶基因miRNA的相对表达含量2-△△Ct表示)。

2 实验结果

2.1 外泌体的形态学特征 实验通过ExoQuick试剂盒提取脑脊液外泌体后，应用透射电子显微镜观察可发现在3组不同脑脊液中均可看到边界较清晰、中间较周围淡染的类圆形或椭圆形囊泡，形态、大小均匀，囊泡内可见致密低电子影(见图1)。

2.2 CD9、CD63在脑脊液外泌体中的表达 琼脂糖电泳、蛋白印迹法检测结果显示，脑脊液中外泌体表达CD9、CD63蛋白(见图2)，该实验结果进一步说明脑脊液中外泌体的存在。

2.3 脑脊液外泌体let-7家族的表达 实验通过miRNA提取剂分别提取外泌体及脑脊液let-7家族中let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i，其中 let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7g、let-7i均有不同程度表达，let-7f不表达，let-7b表达含量最高(见图3),而脑脊液中let-7家族中let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7g、let-7i未表达。

2.4 脑脊液外泌体中let-7b的实时荧光定量PCR结果 实时荧光定量PCR检测let-7b在3组不同脑脊液外泌体中的相对表达，通过统计学分析结果如下(见图4)：(1)结脑组脑脊液外泌体中let-7b的表达显著低于对照组，差异具有明显统计学意义(*P<0.05)；(2)病脑组与对照组相比，病脑组let-7b表达下调，差异具有统计学意义(*P<0.05)；(3)结脑组与病脑组相比,结脑组let-7b表达下调，但差异无统计学意义(nsP>0.05)。

图1 A:为结核性脑膜炎脑脊液中外泌体(×40.0 k)；B:为病毒性脑膜炎脑脊液中外泌体(×25.0 k)；C:为正常对照组脑脊液中外泌体(×70.0 k)

图2 CD9、CD63在脑脊液外泌体中的表达

注：M为Marker；1-8为let-7a至let-7i；9为内参U6

图4 不同组脑脊液外泌体中let-7b的相对表达量

3 讨 论

最近发现一种新的细胞通讯机制：胞外囊泡(EV)通讯，包括脱落微泡、外泌体、凋亡小体等类型，其中外泌体可包裹多种脂质、蛋白质及miRNA等，在生理和病理条件下形成并释放、与靶细胞结合，介导细胞与细胞之间的物质传递、信息交流[5]。也被证实在外泌体中存在大量RNA以及miRNA，且具有miRNA富集作用[6,7]。如科学家运用基因芯片分析研究发现miR-451、miR-16、miR223、let-7b、let-7i在人体血清外泌体中含量较高，表现出特异的靶向性以及独特的生物学特性[8]。

Let-7家族作为miRNA家族中的一员，最早在秀丽隐杆线虫中发现，参与其发育调节过程，具有高度保守性[9]。哺乳动物体内，let-7家族有let-7a(1-3)、et-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f(1-2)、let-7g、let-7i、miR-98、miR-202共13个，分布于肺、肝脏、胰腺等不同组织器官的单核细胞、上皮细胞、骨髓间充质干细胞、神经细胞等多种细胞中，参与细胞分化、炎症反应、肿瘤增殖等多种生命过程的调控。如Johnson等[10]科学家通过体外实验显示let-7在正常肺组织细胞中表达水平增高，抑制细胞增殖；而肺癌细胞中let-7表达水平上调时，抑制癌细胞的增殖[11]。朊蛋白感染的神经元外泌体中miR-146a表达下调，let-7家族中的let-7b、let-7i[12]。

脑膜炎是病毒、细菌、真菌、螺旋体等病原体侵犯软脑膜及脊髓膜引起的中枢神经系统感染性疾病，如结核性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎、脑膜神经梅毒等。结核性脑膜炎是一种肺外结核病，但近年来由于抗生素滥用、免疫抑制剂的广泛应用，导致结核耐药菌菌株的大量产生，发病率逐渐升高。但结核杆菌常规培养时间长、假阴性结果多，耽误患者确诊诊断时机并推迟治疗时间[13,14]。

腰椎穿刺脑脊液检查是中枢神经系统感染性疾病的主要手段，早期脑膜炎患者脑脊液的表现并不特异，寻求结核性脑膜炎早期诊断标志物是目前的一个研究热点。Tripathi[15]等科学家通过体外实验结核分枝杆菌(MTB)感染的THP-1巨噬细胞中发现let-7b的下调促进了THP-1细胞的凋亡，MTB清除增强。在肺结核患者中let-7b通过调控TLR-NF-κB信号通路参与介导的结核病的发展[7]。Kar[16]等研究报道let-7b在脑海绵状血管畸形(CCM)病理标本中检测表达下调，可能与CCM的形成有关。

综上所述，本实验检测3组患者脑脊液外泌体中let-7b的表达水平，发现结核性脑膜炎患者脑脊液外泌体中let-7b的表达水平下降，本课题组另一实验let-7d在结核性脑膜炎具有相似表达[17]。除此之外有研究报道抗NMDAR脑炎患者let-7b的表达水平亦显著下调[18]。结合外泌体膜的稳定性及let-7b的高保守性，脑脊液外泌体中let-7b的表达可作为结核性脑膜炎的潜在的临床诊断标志物，进行疾病的诊断及相关脑炎的鉴别诊断。let-7b调控除了与Fas蛋白、TLR-NF-κB信号通路有关，具体的调控作用机制、结核性脑膜炎疾病治疗前后的变化及在其他神经系统疾病中生理病理变化仍需进一步的探索研究。

总而言之，let-7b在结核性脑膜炎患者脑脊液外泌体中表达下调，可作为该疾病的诊断及相关脑炎的鉴别诊断的潜在生物学标志物，但其具体的调控作用机制、结核性脑膜炎疾病治疗前后的变化及在其他神经系统疾病中生理病理变化仍需进一步的探索研究。