miR-9和miR-34c在老年痴呆患者血清中的表达及临床意义

李 晖， 蒋 毅， 刘 颖

老年痴呆属于神经系统退行性疾病，随着我国人口老龄化现象加剧，其发病率逐年增加。由于多数患者不能及时得到有效治疗导致其出现不同程度的认知障碍，严重影响患者本人的生活质量，并且给其家庭带来极大的经济负担。因此，寻找有效诊断和治疗老年痴呆的新靶点或新方法尤为重要。miRNA是一类小分子非编码单链RNA分子，长度约为20～25个核苷酸，在基因转录、表达以及大量蛋白质功能调控中发挥重要作用[1]。研究发现，miRNA与神经系统相关疾病如老年痴呆、帕金森病、胎儿畸形、抑郁症等关系密切[2～4]。miR-9与miR-34c均参与神经系统发育过程，与帕金森病等神经退行性疾病密切相关[5,6]。老年痴呆与帕金森均为神经退行性疾病，以神经元变性为主要改变，细胞丢失是其共同特征，但miR-9和miR-34c在老年痴呆中的研究却鲜有报道。本文通过检测老年痴呆患者血清中miR-9和miR-34c表达，并分析其对老年痴呆的诊断价值，以期为老年痴呆的诊断治疗提供新的方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年10月-2018年2月期间到本院治疗的73例老年痴呆患者作为研究对象，男性46例，女性27例，年龄60～89岁，平均年龄(76.4±5.6)岁。纳入标准：(1)符合美国精神病协会“精神障碍诊断和统计工作手册第四版修正版”(DSM-Ⅳ-R)中关于痴呆诊断标准；(2)临床痴呆分级量表(CDR)评定，评分>1分；(3)简易精神状态检查量表(MMSE)<24分。排除标准：(1)有抑郁病史、精神分裂等精神类疾病；(2)合并高血压、糖尿病患者；(3)心脏、肝、肾功能等严重受损、脑卒中、心肌梗死、贫血、听觉障碍者；(4)资料不完整者。同时选取70例同一时期来我院体检健康者作为正常组，男性38例，女性32例，年龄62～86岁，平均年龄(77.3±6.4)岁。两组患者在性别、年龄、受教育程度方面比较无差异性(P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会讨论后批准，患者及家属对本次研究均知情同意并签署了知情同意书。

1.2 血样采集及指标测定 采集所有受试者清晨空腹静脉血5 ml，置于无菌促凝管中，静置后离心收集上层血清，置于-80 ℃冰箱保存备用。采用酶法检测所有研究者血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、脂联素(ANP)、同型半胱氨酸(Hcy)含量，直接法检测高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，所有试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，严格按照说明书进行操作。

1.3 RT-qPCR法检测血清中miR-9和miR-34c的水平 按照miRNA试剂盒说明书对血清中miRNA进行提取，采用反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以U6为内参，进行检测。反应条件为：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，总共进行40个循环。内参U6、miR-9和miR-34c引物序列(见表1)。

1.4 痴呆分级量表(CDR)评定 测评内容包括记忆力、意动定向力、解析问题能力、社会事物认知、家居生活料理、业余习惯嗜好、个人自理状况等。依据评分结果，分为健康(0分)、可疑痴呆(0.5分)、轻度痴呆(1分)、中度痴呆(2分)、重度痴呆(3分)。由同一位临床经验丰富的精神科高年资医师进行测评和汇总。

2 结 果

2.1 一般资料比较 与正常组相比，老年痴呆患者血清TC水平上升、TG水平下降，但差异均不显著(P>0.05)；LDL-C和Hcy水平显著上升，HDL-C、ANP水平以及MMSE评分显著下降，差异显著(P<0.01)(见表2)。

表1 内参U6、miR-9和miR-34c引物序列

表2 一般资料比较

与正常组比较*P<0.05

2.2 正常组与老年痴呆患者组血清中miR-9和miR-34c表达 与正常组相比，老年痴呆患者组血清中miR-9表达水平均明显下降(P<0.01)，miR-34c表达水平均明显上升(P<0.01)(见图1)。

2.3 不同分组老年痴呆患者血清miR-9和miR-34c表达水平 依据CDR评分结果，将老年痴呆患者分为轻度痴呆、中度痴呆、重度痴呆3组，各组患者血清miR-9和miR-34c表达水平。随着痴呆程度的加重，患者血清miR-9呈下降趋势，miR-34c呈升高趋势，具有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

2.4 相关性分析结果 Pearson相关性分析表明：(1)老年痴呆患者血清中miR-9与血清LDL-C、Hcy水平均呈负相关，与HDL-C、ANP水平以及MMSE评分均呈正相关；(2)老年痴呆患者血清中miR-34c与血清LDL-C、Hcy水平均呈正相关，与HDL-C、ANP水平以及MMSE评分均呈负相关。相关系数(见表3)。

2.5 miR-9和miR-34c表达水平对老年痴呆的诊断价值 ROC分析结果显示miR-9的敏感度为89.58%、特异度为80.00%、截断值为0.87；miR-34c的敏感度为91.67%、特异度为71.11%、截断值为1.14。结果(见图1、表5)。

表3 不同分组老年痴呆患者血清miR-9和miR-34c表达水平比较

表4 miR-9和miR-34c与血清其他指标的相关性分析

表5 血清miR-9和miR-34c表达水平对老年痴呆ROC分析

图1A:血清miR-9和miR-34c表达水平(与正常组相比*P<0.01);图1B:血清miR-9和miR-34c表达的ROC曲线

3 讨 论

我国老年痴呆患者人数达950万多，位居全球第一位，预计到2050年，患者人数将达到三千多万[7]。老年痴呆因其早期诊断困难，缺乏有效药物，治疗效果差，一直以来都是国内外研究的热门话题。积极寻找特异性早期诊断和治疗的生物学标记物，尤其是血液当中的标记物是当前的重中之重。

有研究者对老年痴呆患者外周血细胞凋亡因子Fas/FasL研究发现其与患者发生痴呆呈正相关，可通过对患者外周血相关指标水平的测定判断病情严重程度[8]。同型半胱氨酸(Hcy)是一种含硫基氨基酸，正常情况下，血同型半胱氨酸在体内能被分解代谢，浓度维持在较低水平。当其表达异常会增加冠心病、外周血管疾病及脑血管疾病的发病风险。有研究表明，老年痴呆患者外周血中Hcy水平明显升高，是造成发病的危害因素[9]。本研究结果表明老年痴呆患者Hcy水平高于健康人体，提示Hcy可能与老年痴呆的发生相关，为临床治疗和预防痴呆提供新思路，从降低Hcy水平入手，可能有助于延缓老年痴呆病情进展。有研究表明高血脂与老年性痴呆的发生相关，本研究结果表明老年痴呆患者LDL-C水平明显上升，HDL-C水平明显下降，与相关文献报道的结果一致[10]，提示LDL-C和HDL-C在老年性痴呆病情程度鉴别当中可作为参考指标。ANP是脂肪组织分泌的蛋白，有研究报道称血清中高浓度的ANP可以改善保护老年痴呆患者的认知功能[11]，本研究表明老年痴呆患者血清ANP水平明显低于健康人体，与相关研究报道一致[12]，提示ANP与老年痴呆的发生、发展过程相关。

miRNA是一类小分子非编码单链RNA分子，能够在后转录水平通过碱基互补配对的方式与靶信使RNA的3’端非翻译区结合抑制该mRNA的翻译过程或使mRNA降解，进而影响相关基因表达[13]。研究发现，miRNA参与细胞生长、分化等生命过程，与多种疾病发生发展关系密切[14]。除此之外，miRNA表达组织特异性较好，稳定性较高，具有以下优点：第一，血清样本易得，花费成本较小；第二，miRNA能在强酸、强碱等极端条件及温度下长期存放，几乎不受外界环境干扰；第三，为非侵入性检测指标，对人体无其他伤害作用[15]。miR-9属于miRNA家族重要成员之一，有两种存在形式：前体miR-9和成熟miR-9，仅有成熟的miR-9才能够在生物体中发挥重要的功能[16]。研究表明，miR-9可能通过抑制锌指蛋白521表达，促进BMSCs向神经细胞分化[17]；miR-9可能通过调控突触小泡磷酸酶1和突触孔蛋白等基因表达影响神经元间突触传递递质的功能，从而影响神经元活性[18]。本研究结果表明，老年痴呆患者血清中miR-9表达水平比正常健康人显著下降，说明痴呆患者miR-9水平呈低表达，miR-9可能通过抑制神经元分化影响老年痴呆发展过程。ROC结果显示miR-9的敏感度为89.58%、特异度为80.00%、截断值为0.87，说明检测患者血清miR-9的相对表达量低于0.87时极可能已发生老年痴呆，推测miR-9可能为临床诊断老年痴呆的重要血清标志物。

miR-34同样是miRNA家族的重要成员，在哺乳动物基因中，miR-34有3个成员，miR-34a、miR-34b、和miR-34c。其中miR-34c定位于染色体11q23，与学习记忆的形成相关，是认知功能的潜在调控因子[19]。miR-34c与海马记忆功能相关，其高度表达能够调控一些与记忆形成相关的基因。研究发现，miR-34c在海马神经元中过表达负向调节树突长度和脊柱密度，用miR-34c转染的海马神经元树突较短，丝状伪足和脊柱较少[20]。因为树突和突触是信号转导的关键位点、记忆形成和储存的基本结构，树突受到损伤后易引发老年痴呆。因此，miR-34c通过影响树突和突触，造成老年痴呆患者学习记忆障碍。小鼠海马被注射miR-34c抑制剂后，SIRT1的表达回复至生理学水平，在老年鼠中降低miR-34c表达后，SIRT1的表达同样恢复至生理水平，且小鼠的学习行为也得到了改善[21]。本研究结果表明老年痴呆患者血清中miR-34c表达水平显著升高，与患者MMSE评分负相关，推测其上调促进了SIRT1的表达，进而使患者认知功能出现障碍，有待进行更深入探讨。ROC分析结果显示miR-34c具有较高的敏感性及特异性，推测miR-34c可作为临床诊断老年痴呆的预测因子之一。本研究结果显示老年痴呆患者组血清miR-9和miR-34c水平与Hcy、ANP、患者精神状态评分等均相关，且依据CDR评分，患者痴呆程度越严重，miR-9水平越低，miR-34c水平越高，提示miR-9和miR-34c水平能反应痴呆程度。

综上所述，测定老年痴呆患者血清中miR-9和miR-34c表达水平，对于诊断、治疗老年痴呆患者具有一定的参考价值，但本研究由于受样本数量较少、患者自身基础疾病等因素的影响，研究结果可能具有一定的偏差，后续需要扩大样本量，排除其他因素的影响，对miR-9和miR-34c表达异常的机制等进行更深入的研究。