不同酒曲发酵生产木薯酒香气成分GC-MS分析

张婷，陈小伟，张沙沙，范昊安，薛淑龙，蒋立新，赵万钙，姚刚，蔡海莺，*，毛建卫，*

（1.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江杭州310023；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州310023；3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，浙江杭州310023）

木薯（拉丁名Manihot esculenta Crantz，英文名Cassava），为大戟科直立灌木，与甘薯、马铃薯并称之为世界三大薯类。但木薯含有少量有毒氰化物，需有效的脱毒技术来降解甚至去除其毒性。比如采用水浸法对剥皮后的木薯块根总生氰糖苷的去除率达到97.90%[1]，或通过蒸煮使木薯中生氰糖苷量降低80%[2]。甜木薯是木薯种类之一，其生氰糖苷含量极低，可供人安全食用。近年来木薯酸奶[3]、木薯饼干[4]、木薯面包[5]和木薯甜酒[6]等深加工产品层出不穷。据报道，黄发新等[7]以粗木薯粉为原料，以米曲霉作液化剂、黑曲霉作糖化剂及酒母作发酵剂酿造木薯白酒；袁子娇[8]以鲜木薯为原料加中草药、调香花卉及甜酒曲酿造养生保健的木薯甜酒。木薯酒具有木薯特有的风味，口感醇厚，老少皆宜，深受消费者喜爱[6]。木薯酒的香气直接影响其感官品质，是反映其风格的一个重要指标[9]，但目前国内外对木薯酒酿造工艺报道较多，对其香气成分罕有研究。

本研究以甜酒曲、白酒曲分别对鲜木薯采取相同工艺进行发酵，采用顶空-固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）提取酒样中香气成分，并结合气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对其进行检测分析，通过对比分析不同酒曲酿造木薯酒的主要香气成分组成及相对含量的差异，为木薯酒的香气特征研究提供科学依据，也为进一步有效开发和利用木薯资源提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白肉甜木薯：采自广西省防城港市的木薯基地；安琪风味型甜酒曲、安琪白酒曲：安琪酵母股份有限公司。

乙醇（色谱纯）：美国Sigma公司；葡萄糖、蒽酮、硫酸、氢氧化钠、10%福林酚、甲醇（分析纯）：国药化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（FA2004）：海舜宇恒平科学仪器有限公司；紫外分光光度计（UV-5500PC型）：上海市元析仪器有限公司；精密酸度计（PHS-3C）：上海佑科仪器仪表有限公司；气相-质谱联用仪（7890A-5975C）：美国安捷伦公司；手动固相微萃取装置（附带57310-U，65 μm，PDMS/DVB萃取头）：美国Supelco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 木薯酒的工艺流程及操作要点

鲜木薯→清洗→去皮→切片→蒸煮→冷却→加水打浆→拌曲发酵→过滤→高温杀菌→成品

实验采用五折交叉验证法，将每个数据集等分五份进行五次实验，每次实验记录查全率和查准率，并计算F-value数据，每个数据集进行五次实验的F-value数据如图2；其均值和标准差如表3所示，算法采用MATLAB编程实现。

制备过程中操作要点如下：

1）挑选无病虫害，无霉烂的鲜木薯，先清洗干净，后削皮，再切成8 mm～10 mm厚度的块状，进行常压蒸煮至无硬心而不烂，进行软化，蒸煮后冷却至常温。

2）按块状熟木薯∶去离子水=1∶2的质量比进行打浆。

3）熟木薯打浆液中按质量比550∶0.5加入酒曲，发酵温度30℃，发酵时间108 h，此时发酵液中上清液澄清且无气泡产生。取3个平行酒样，且酒样于10 000 r/min条件下离心20 min，取上层清液置于-85℃超低温冰箱储存，待测。

1.3.2 木薯酒理化指标测定

木薯酒中酒精度的测定采用国标GB 5009.225-2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》的第三法；总糖含量的测定采用蒽酮-硫酸法[10]；总酸含量的测定采用国标GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的指示剂法；总酚含量的测定采用福林酚法[11]。

1.3.3 木薯酒的香气成分提取

利用HS-SPME对不同酒曲发酵的木薯酒挥发性香气成分进行富集。准确吸取1 mL不同酒曲发酵的酒样，置于15 mL的固相微萃取样品瓶中，加入0.5 g氯化钠，以促进香气成分挥发，再加入磁力转子，迅速用含有聚四氟乙烯隔垫的样品盖将样品瓶密封，将样品瓶置于固相微萃取工作台上进行50℃水浴平衡30 min，使氯化钠充分溶解，待挥发性物质与上部空气、下部溶液互相平衡后，将已活化的萃取头插入样品瓶的顶空部位，推出萃取头使其暴露于萃取瓶顶空中进行萃取，萃取吸附30 min。当样品萃取平衡后，缩回纤维头，吸附后的萃取针头迅速插入气相色谱（gas chromatography，GC）进样口，推出纤维头于250℃解吸5 min，同时启动GC，分析酒样并采集数据。

1.3.4 木薯酒的香气成分分析

利用GC-MS测定2种酒曲发酵的木薯酒香气成分种类及相对含量，对比分析其共同点及差别。

GC条件：DB-5MS色谱柱（50m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度为250℃；升温程序为初始温度40℃保持5 min，以5℃/min的升温速度升到230℃后，保持10 min；传输线温度为280℃；载气为高纯氦气，其流速为1.0 mL/min；采用不分流模式进样。

MS条件：电离方式为电子轰击离子源；电子能量70 eV；离子源温度250℃；质量扫描范围30 amu～500 amu。

1.4 数据统计与分析

试验中的检测分析包括木薯酒的酒精度、总糖、总酸、总酚及香气成分含量。对采集到的香气成分质谱图通过计算机检索，与NIST 08.L谱库提供的标准质谱图对照以及人工解析进行确认，再结合保留时间等参数对部分组分进一步确定。确认各个挥发性风味成分，并用EXCEL对数据进行统计分析和制图。

2 结果与分析

2.1 不同酒曲发酵的木薯酒理化指标分析

对木薯酒进行理化指标测定，结果见表1。

由表1可知，白酒曲发酵的木薯酒比甜酒曲发酵的木薯酒中酒精度高、残糖量低、酸度高，总酚含量高。

2.2 不同酒曲发酵的木薯酒中香气成分GC-MS分析

经GC-MS分析的总离子流图见图1、图2。

表1 不同酒曲发酵的木薯酒理化指标Table 1 Physicochemical indexes from different koji fermented cassava wine

图1 甜酒曲发酵的木薯酒香气成分的GC-MS总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of aroma components of cassava wine fermented with sweet wine koji

图2 白酒曲发酵的木薯酒香气成分的GC-MS总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components of cassava wine fermented with spirits koji

由图1、图2可知在得到的挥发性物质中，存在一些硅氧烷类等杂质，它们并不是木薯酒中所存在的挥发性物质，可能与萃取头的表面材料有关。除此之外，从2种酒曲发酵后得到木薯酒鉴定的挥发性成分如表2所示。

从表2可知，2种酒曲发酵的木薯酒中共检测出73种挥发性物质，包括醇类14种、酯类25种、酸类5种、醛类7种、酮类3种、芳香类5种、烷烃类3种、胺类6种和醚类3种以及其他类2种。通过定性分析，木薯甜酒中检测出挥发性成分的种类较多，共54种，而木薯白酒只有31种，其中共同的组分中醇类有3种、酯类6种、醛酮类2种、芳香类1种。不同酒曲发酵的木薯酒都各自含有不同的特有香气成分。乙酸戊酯、2-甲基乙酸丁酯、2，6-二甲基-4-庚醇仅在木薯甜酒中检测到，而乙酸苯乙酯、壬酸乙酯为木薯白酒所特有的挥发性成分。

表2 不同酒曲发酵的木薯酒挥发性风味物质分析结果Table 2 Analysis of volatile compounds from different koji fermented cassava wine

续表2 不同酒曲发酵的木薯酒挥发性风味物质分析结果Continue table 2 Analysis of volatile compounds from different koji fermented cassava wine

2.3 不同酒曲发酵的木薯酒挥发性香气成分分析

从表2可知，木薯甜酒和木薯白酒中检测出的挥发性成分的总相对含量皆高于80%，且两者木薯酒的香气成分中醇类和酯类占的相对含量较高，这说明在酒中醇类和酯类物质是木薯酒香气的重要组成成分。甜酒曲，白酒曲分别发酵的木薯酒中醇类、酯类、醛类、酮类及芳香类物质的相对含量差别较为明显，如白酒曲产醇能力较强，其发酵的酒样中醇类物质的相对含量比甜酒曲发酵的酒样高26.48%，而甜酒曲产酯、产醛酮及产芳香类能力均为较高水平。醇类物质在呈香上起主要作用，同时也是形成酯类物质的前体[12]，而胺类、酸类、烃类、醚类及其他类等香气成分在这两种木薯酒中相对含量差异较小。

2.3.1 醇类香气成分比较分析

醇类是构成发酵酒香气的主要物质，主要是酵母在酒精发酵过程中利用氨基酸或糖代谢产生的次级产物[13-14]，对木薯酒品质有重要影响。由表2所知：木薯发酵后的主要香味物质为醇类，木薯甜酒、木薯白酒中共检测出14种醇类化合物，其相对含量分别占总挥发性成分的86.93%、98.06%，共同含有的醇类有3种，分别是乙醇、异戊醇、β-苯乙醇，且其在木薯酒中的相对含量较高。这说明这3种醇类物质是木薯酒的关键性风味物质，但在不同酒样中的相对含量有所差异。白酒曲发酵的木薯酒中醇类物质含量最高，这说明白酒曲总体产醇能力要优于甜酒曲。少量醇类能够赋予果酒优雅的香气，如乙醇具有令人愉快的香味；异戊醇具有淡雅细腻的花香和果香[15]，是木薯酒主体香气成分之一。β-苯乙醇不仅具有良好的抗菌性能，且富有香味浓烈、持久的玫瑰花香和木香[15]。

2.3.2 酯类香气成分比较分析

挥发性酯类是各大香气化合物中的最重要组成，赋予葡萄酒或发酵饮料的主要果香味[16]，这极大影响酒的主体香型及风格[17]。木薯甜酒、木薯白酒中共检测出25种酯类化合物，其相对含量分别占总挥发性成分的11.10%、1.59%，说明甜酒曲的总体产酯能力要优于白酒曲。相对含量较高的酯类物质如丁二酸二乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，这些皆是2种木薯酒中共存的挥发性香气成分。大多数酯类具有花、果香气，对木薯酒的香气质量贡献较大。如丁二酸二乙酯具有水果香和花粉香[18]，乙酸异戊酯具有苹果香[18]，辛酸乙酯赋予木薯酒强烈的菠萝果香与花香[19]。乙酸苯乙酯的相对含量较高，对木薯白酒的香气贡献较大。但苯乙酸乙酯和癸酸乙酯的相对含量较低，对木薯甜酒和木薯白酒的香气贡献较小。因此，酒曲的选择会直接影响到木薯酒发酵所产生的酯类种类与相对含量，决定酒的香型。

2.3.3 酸类香气成分比较分析

酸类是酵母微生物发酵的次级代谢产物[13]，是烷烃类化合物经氧化而成的最终产物[20]，能保持酒体平衡和口感清爽的特征。适宜的含酸量能使酒带有鲜水果香，能修饰酒滋味和口感，且有利于形成瓶贮酒香[21]。酸类成分和含量也受到微生物菌株的影响[22]。在木薯甜酒、中酸类香气化合物只有1种，即2-氨基-5-甲基苯甲酸。而木薯白酒中酸类香气化合物有4种，含量最高的是DL-苹果酸。

2.3.4 醛及酮类香气成分比较分析

酮类物质可能因为多不饱和脂肪酸经热氧化或降解，以及氨基酸降解或微生物氧化而产生的[23]。在木薯甜酒、木薯白酒中共检测出醛、酮类物质10种。甜酒曲所发酵的酒样中苯乙醛、壬醛的相对含量高于白酒曲发酵的酒样，且苯甲醛是甜酒曲所发酵的酒样中所特有的香气成分，同时苯甲醛含量的多少也造成了两种木薯酒的醛类化合物总量的差距。木薯酒中醛酮类物质的存在对其香气有一定的贡献，如苯甲醛具有杏仁香、樱桃香及坚果香[15]；苯乙醛能赋予木薯酒玫瑰花香，有先苦后甜的桃子味[24]；壬醛呈玫瑰花、青草味[18]。

3 结论

本文采用HS-SPME技术对不同酒曲发酵的木薯酒挥发性香气成分进行提取，并通过GC-MS对其进行分析，2种酒曲发酵的酒样中共鉴定出香气成分73种，主要包括醇类、酯类、酸类、醛类、酮类、芳香族类、烷烃类、胺类和醚类等。甜酒曲和白酒曲发酵的木薯酒中共检测出香气成分54、31种，且共有的挥发性成分有12种。由分析可知，两者酒样香气的差异主要表现在香气成分组成和相对含量两个方面。两种木薯酒中相同的香气成分有12种，其中含量最高的5种香气成分依次为：乙醇、异戊醇、β-苯乙醇和丁二酸二乙酯。对应的相对含量依次为：甜酒曲42.58%、15.08%、15.08%、3.19%，白酒曲70.41%、11.57%、10.55%、0.21%。由此可见木薯酒的主体挥发性成分为醇类及酯类化合物，这与Kang M等[18]对柑橘果酒的挥发性风味化合物研究结果相似。主体香气成分大部分相同说明三者使用相同原料酿造的酒在香气成分组成上的一致性，而其相对含量以及各酒样特有香气成分的差异又说明木薯酒发酵时酒曲的不同对其香气的形成具有重要作用。

不同酒曲发酵的木薯酒都各自含有不同的特有香气成分。如乙酸戊酯、2-甲基乙酸丁酯、2，6-二甲基-4-庚醇仅在木薯甜酒中检测到，而乙酸苯乙酯、壬酸乙酯为木薯白酒所特有的挥发性成分，且木薯白酒中未检测到酮类，烷烃类。通常情况下，挥发性香气化合物对酒总体风味的贡献由其种类、含量、香气阈值及其相互协调作用共同决定，最终使木薯酒体现出特有的果香和发酵香等香气特征，另外特征组分的鉴定还需人体嗅觉感官分析的协助或气相色谱与嗅觉测量技术联用等相关技术才能够完成。