羊栖菜褐藻酸钠对便秘模型小鼠的润肠通便作用

程阳，吴思雅，侯玲凤，蒋慧静，吴宇峰，吴明江，张旭

（温州大学生命与环境科学学院，浙江温州325000）

便秘是消化系统的常见症状之一，是一种功能性肠道疾病[1]。便秘的成因常常是粪便长时间驻留在肠道内，排便次数减少，粪便干燥，排出费力[2]，进而引起排便异常，即形成便秘。随着生活节奏的加快和膳食结构的变化，便秘的发病率在逐年上升，逐渐成为当今社会常见的临床症状，严重影响人们的生活质量和身体健康。现代研究表明，便秘可导致肛肠疾病、胃肠疾病、结肠癌、心脏病，并可影响大脑功能[3]。目前使用泻药是临床上用于治疗便秘的主要方法，该法通过刺激患者肠道分泌并减少肠道内吸收的方法达到治疗便秘的目的。但长期使用泻药所产生的毒副作用会对人体产生威胁，如引起肠粘膜吸收障碍，严重时会出现体内脱水，电解质紊乱，甚至出现顽固性便秘[4]。因此，便秘越来越受到人们的重视。寻找一种毒副作用小且能缓解便秘的天然产物，已逐渐成为医学研究的热点方向。

羊栖菜[Sargassum fusiforme（Harv.）Seteh.]隶属褐藻门，圆子纲，墨角藻目，马尾藻科，马尾藻属，是药食两用的大型海藻，素有“长寿菜”之美誉[5-6]。羊栖菜生长于沿海地区，在中国、日本和韩国的沿海地区均有分布。目前，羊栖菜已在我国南方的海区大量人工养殖，是一种重要的出口创汇海藻资源。在《神农本草经》[7]上即有关于羊栖菜的食疗性质和给药方法的记载。羊栖菜性味苦、咸、寒，具利水消肿，泻热化痰，消食化瘀功能。羊栖菜多糖（S.fusiforme polysaccharides，SFPS）是羊栖菜的主要活性成分，包括褐藻酸（约占干重的28.4%）、岩藻聚糖硫酸酯（约占干重的8.1%）和褐藻淀粉（约占干重的0.5%）[8]。羊栖菜多糖具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂和免疫调节等多种药理活性[9-10]，近年来对羊栖菜多糖中岩藻聚糖硫酸酯的活性研究较为广泛，而对含量更高的褐藻酸研究相对较少。褐藻酸广泛存在于海带、马尾藻等褐藻植物细胞壁中，由英国人Stanford在1881年首次从中分离得到。它不溶于氯仿、丙酮、乙醇等有机溶剂，是一种水溶性酸性多糖物质。褐藻酸由1，4-β-D-甘露糖醛酸（M）和1，4-α-L-古罗糖醛酸（G）两种糖醛酸单体聚合而成。褐藻酸主要以游离酸、一价盐（钠盐、钾盐）和二价盐（钙盐等）的形式存在于自然环境中，商品褐藻酸主要以钠盐为主[11]。有研究表明，褐藻酸钠具有抗病毒、提高免疫力、清除自由基、促进益生菌增殖、促进生长等作用[12-14]。研究表明许多天然多糖类化合物具有改善动物体内肠道微生态的作用，可起到益生元的效果，是理想的通便功能剂和微生态调节剂[15-18]。然而，羊栖菜褐藻酸钠是否具有润肠通便功效，仍未见文献报道。本试验研究羊栖菜褐藻酸钠对便秘模型小鼠的润肠通便作用，对揭示羊栖菜褐藻酸钠调节肠胃功能的机理具有重要的理论意义，同时为羊栖菜功能食品的开发提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊栖菜自浙江省温州市洞头区羊栖菜养殖基地，采集时间为2017年10月初，经温州大学生命与环境科学学院植物分类教研室鉴定为褐藻门马尾藻科马尾藻属植物羊栖菜；健康雄性ICR小鼠，8周龄，体质量为18 g～22 g，购于温州医科大学实验动物中心，动物使用许可证号SYXK（浙）2015-0009。

复方地芬诺酯（有效成份为地芬诺酯，每片含有效成份量为2.5 mg）：长春长红制药有限公司；阿拉伯树胶、活性炭（粉状）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：巩义市予华仪器有限责任公司；红外光谱仪（Tensor 27）：BRUKER公司。

1.3 方法

1.3.1 羊栖菜褐藻酸钠的制备

羊栖菜经烘干粉碎后脱脂，得脱脂藻粉。脱脂藻粉85℃热水提取3次，每次3 h。过滤后，取滤渣在80℃下用2%的碳酸钠提取3次，每次3h，每1kg样品中加入30 L的水，合并滤液并过滤，得到褐藻酸提取液。用1 mol/L盐酸调pH值至6～7，加入等体积100g/L的氯化钙溶液，轻轻搅拌使其充分絮凝，静置1 h，8 000 r/min离心得到褐藻酸钙。向褐藻酸钙中加入1 mol/L盐酸，不断搅拌，调节pH值至2，酸化2 h后，加入40 g/L的氢氧化钠溶液，至溶液pH值为8。溶液经800 r/min离心后，冷冻干燥，得到褐藻酸钠样品[19]，提取率约为20%。

1.3.2 糖醛酸、蛋白质含量测定

利用间羟基联苯法测定糖醛酸含量[20]；利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[21]。

1.3.3 红外光谱分析

取少量干燥样品，加入适量溴化钾粉末，并在红外干燥箱中充分研磨，压片，在500 cm-1～4 000 cm-1范围内进行红外扫描。

1.3.4 动物分组及给药

试验方案参照《保健食品检验与评价技术规范》[22]。雄性ICR小鼠60只，饲养条件为湿度（60±5）%，温度（25±1）℃，12 h的光照以及12 h黑暗，自由摄食饮水。适应性饲养一周后，将小鼠随机分为6组，即空白组、模型组和4个褐藻酸钠剂量组 [分别为30、100、300、1 000 mg/（kg·d）]，空白组和模型组均灌胃蒸馏水。每天1次，连续7 d，在试验前后称量每只小鼠的体重。

1.3.5 小鼠排便试验

根据《保健食品检验与评价技术规范》制备墨汁以及复方地芬诺酯混悬液。

墨汁的制备：准确称取阿拉伯树胶100 g，加入800 mL水，混合并煮沸至溶液澄清后加入50 g活性碳粉，煮沸3次，待溶液冷却后加水定容至1 000 mL，4℃保存。复方地芬诺酯混悬液（用于建立小鼠小肠蠕动抑制模型）的制备：分别取复方地芬诺酯粉末25 mg和50 mg，加入蒸馏水100 mL配制成质量浓度为250 μg/mL和500 μg/mL的复方地芬诺酯混悬液，灌胃剂量分别为5 mg/kg和10 mg/kg。

末次给药后，小鼠禁食不禁水16 h，除空白组小鼠灌胃同体积的蒸馏水外，其余各组分别灌胃500 μg/mL的复方地芬诺酯混悬液10 mg/kg。30分钟后，剂量组灌胃含相应褐藻酸钠的墨汁，空白组和模型组灌胃墨汁，同时开始计时。每只小鼠单独饲养，自由饮水、摄食，观察记录每只小鼠首次排黑便的时间、5 h排黑便粒数，并及时称量排出粪便的质量。

1.3.6 小肠运动试验

再选取雄性ICR小鼠60只，动物饲养分组同1.3.5节。末次给药后，各组小鼠禁食不禁水16 h，除空白组小鼠灌胃同体积的蒸馏水外，其余各组分别灌胃250 μg/mL的复方地芬诺酯混悬液5 mg/kg。30分钟后，剂量组灌胃含相应褐藻酸钠的墨汁，空白组和模型组灌胃墨汁，同时开始计时。灌胃墨汁25分钟后，颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线进行测量，得到“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按下列公式计算墨汁推进率。

式中：L0为墨汁推进长度，cm；L为小肠总长度，cm。

1.4 统计分析及结果判定

采用Graphpad prism 5软件进行统计分析。在便秘模型成立的条件（P＜0.01）下，小鼠的首次排黑便所需时间、5小时内排便粒数、粪便质量和墨汁推进率的显著性分析均采用单因素方差多重比较（One-Way ANOVA），P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著差异，实验结果以平均值±标准差（±s）表示。参照《保健食品检验与评价技术规范》，上述5小时内排粪便重量和排黑便粒数任一项结果阳性，同时小肠运动实验和首粒排便时间任一项结果阳性，可判定羊栖菜褐藻酸钠对便秘模型小鼠的润肠通便作用的试验结果显阳性[22]。

2 结果与分析

2.1 羊栖菜褐藻酸钠的理化性质分析

羊栖菜褐藻酸钠为棕黄色粉末，易溶于水，糖醛酸含量为76.34%，蛋白质含量为0.6%。

羊栖菜褐藻酸钠的红外光谱见图1。3 426 cm-1处的峰为羟基O-H的伸缩振动，2 930 cm-1处的吸收峰为糖类C-H伸缩振动，1 615 cm-1和1 419 cm-1处的吸收峰分别为-COO-中C=O的非对称伸缩振动和对称伸缩振动，1 306 cm-1处的吸收峰为-COOH中O-H的变角振动，1 092 cm-1和1 036 cm-1处的吸收峰分别为吡喃糖环的醚键（C-O-C）和羟基（C-O-H）的伸缩振动，940 cm-1处的吸收峰为吡喃糖环的非对称环伸缩振动，872 cm-1处的吸收峰为C2和C4位上平伏键构型的C-H的变角振动，817 cm-1处为甘露糖醛酸的特征吸收峰。

图1 羊栖菜褐藻酸钠的红外光谱图Fig.1 Infra-red spectra of Sargassum fusiforme sodium alginate

2.2 羊栖菜褐藻酸钠对小鼠体质量的影响

羊栖菜褐藻酸钠对小鼠体质量的影响见图2。

图2 排便试验和小肠运动试验前后小鼠体质量的比较Fig.2 Effect on body weights by Sargassum fusiforme sodium alginate treatment in defecation experiment and intestinal movement experiment on day 0 and day 7

由图2可知，在排便试验和小肠运动试验中，各组小鼠的初始体质量分别与空白组比较，均无显著性差异（P＞0.05），说明试验中小鼠分组是均衡的。经灌胃处理7天后，各组的小鼠体质量与空白组比较，无显著性差异（P＞0.05），说明羊栖菜褐藻酸钠处理对小鼠体质量没有不良影响。

2.3 羊栖菜褐藻酸钠对小鼠排便的影响

羊栖菜褐藻酸钠对模型小鼠首粒排便时间、排便粒数和粪便质量的影响见图3。

由图3可知，小鼠排便试验中，与空白组比较，模型组的首粒排黑便的时间、5小时内排黑便粒数和粪便质量均有极显著性的差异（P＜0.01），表明小鼠便秘模型建立成功。与模型组相比，羊栖菜褐藻酸钠的300 mg/（kg·d）和1 000 mg/（kg·d）组小鼠的粪便粒数、粪便质量以及首粒排便时间有极显著性的差异（P＜0.01），而且随剂量的增加，羊栖菜褐藻酸钠促排便效应增加，呈现剂量依赖性。

图3 羊栖菜褐藻酸钠对模型小鼠首粒排便时间、排便粒数和粪便质量的影响Fig.3 Effect of Sargassum fusiforme sodium alginate on the time for first black excrement，faece number and faece weight

2.4 羊栖菜褐藻酸钠对小鼠小肠蠕动的影响

羊栖菜褐藻酸钠对小鼠小肠墨汁推进率的影响见表1。

表1 羊栖菜褐藻酸钠对小鼠小肠墨汁推进率（±s）的影响Table 1 Effect of Sargassum fusiforme sodium alginate on intestinal ink propelling（±s）

表1 羊栖菜褐藻酸钠对小鼠小肠墨汁推进率（±s）的影响Table 1 Effect of Sargassum fusiforme sodium alginate on intestinal ink propelling（±s）

注：^^表示与空白组相比，差异极显著（P＜0.01）；*表示与模型组比较，差异显著（P＜0.05）；**表示与模型组比较，差异极显著（P＜0.01）。

组别小鼠排便实验指标小肠总长度/cm墨汁推进长度/cm 推进率/%空白组 45.72±2.324 28.18±2.829 61.71±6.134模型组 48.11±4.179 19.22±3.579 40.20±7.625^^褐藻酸钠30 mg/（kg·d）45.45±3.616 22.44±5.338 49.97±14.005褐藻酸钠100 mg/（kg·d）44.10±5.440 22.24±2.822 51.20±9.331*褐藻酸钠300 mg/（kg·d）45.07±3.033 24.61±3.555 54.30±5.437**褐藻酸钠1 000 mg/（kg·d）47.17±1.275 27.46±3.824 58.40±7.454**

由表1可知，模型组的墨汁推进率与空白组差异极显著（P＜0.01），说明便秘模型成立。羊栖菜褐藻酸钠给药组小鼠的墨汁推进率均高于模型组，且呈剂量依赖性。与便秘模型组比较，羊栖菜褐藻酸钠100 mg/（kg·d）剂量组能明显提高墨汁推进率（P＜0.05），300 mg/（kg·d）和1 000 mg/（kg·d）剂量组可以极显著（P＜0.01）提高墨汁推进率，表明羊栖菜褐藻酸钠具有促进小鼠小肠蠕动的作用。

3 结论与讨论

良好的吸水性和保水性是褐藻酸钠的特性。孙春禄将褐藻酸钠和钙盐混合后制成凝胶并加入肉制品中，以观察其对肉制品持水力的影响，发现相同工艺条件下不同凝胶强度的褐藻酸钠对肉制品持水力的影响不同[23]。褐藻酸钠因其具有良好的凝胶特性，常常作为一种乳化剂应用于冰淇淋和雪糕中，可提高冰淇淋和雪糕的体积和膨胀率，口感更好。因此，我们推测羊栖菜褐藻酸钠的通便功能可能与下列因素有关：褐藻酸钠可能在消化道中吸水膨胀，同消化道中其他“废物”形成柔软的粪便，刺激和促进肠蠕动，使之易于排出，同时缩短代谢产物及有害物质在大肠的停留时间，减少这些物质对肠道的刺激时间和重吸收时间。

褐藻酸钠可以显著促进小鼠小肠推进作用，明显缩短排首粒黑便时间，同时增加其5 h排黑便粒数和质量，展现出良好的润肠通便功效。在整个试验过程中，羊栖菜褐藻酸钠没有对小鼠的体质量造成影响，也没有观察到小鼠有腹泻等不良症状，表明其润肠通便作用的温和性。本研究为羊栖菜褐藻酸钠在润肠通便、防治便秘等保健食品领域的深度开发提供了理论支持。