海洋氧化节杆菌KQ11右旋糖酐酶清除甘蔗制糖中右旋糖酐的研究

刘乐，丁一，王淑军，2，房耀维，吕明生，*

（1.淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏连云港222005；2.江苏省海洋资源开发研究院（连云港），江苏连云港222005）

右旋糖酐（又称葡聚糖）是以α-1，6糖苷键连接为主，侧链含有 α-1，2、α-1，3、α-1，4 糖苷键的大分子多聚糖[1]。随着分子量增加，右旋糖酐黏性不断增大[2]。研究表明，制糖过程中绝大部分的糖损失是由微生物污染造成。甘蔗收获后堆放在糖厂，在温暖潮湿的环境下存放14小时后，由于微生物的作用可产生右旋糖酐，其中肠系膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）和乳酸菌（Lactobacillus）是主要的菌群[3-5]。右旋糖酐的产生会导致蔗汁黏度增大、影响沉降速度和清洁效率、旋光度虚假升高等不良后果，对制糖工业造成经济损失[6]。虽然通过物理方法，如超滤、膜透析和反渗透可以清除右旋糖酐，但经济成本相对较高[7]。目前，在制糖业中通用的方法是酶解法[8-9]。

右旋糖酐酶可将右旋糖酐水解成低分子量的糖，从而清除甘蔗汁中的右旋糖酐。目前制糖业中所使用的右旋糖酐酶主要来源于霉菌细丽毛壳菌（Chaetomium gracile）和毛壳菌（Chaetomium erraticum）[10]。霉菌的生产周期较长，酶制备技术存在一定的安全隐患，仍需完善[11-12]。超声波是一种高强度的声波能量，在处理加工具有生物功能的大分子上应用广泛[13]。已有文献报道，超声能够提高酶的催化活性[14]。研究表明，超声波的气穴效应会增强酶在底物分子表面运转，空气的机械冲击会使底物与酶更易复合[15]。本研究使用本实验室保存的海洋氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）KQ11右旋糖酐酶对其清除甘蔗汁中右旋糖酐的条件进行了优化，为其在制糖生产中的应用提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘蔗：购于当地超市，将甘蔗榨汁，经离心机以20 000 g离心20 min，取上清即为甘蔗汁样品；酵母粉：英国Oxiod公司；右旋糖酐20000、鱼粉蛋白胨、氯化钠、硫酸镁、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾、苯酚、无水亚硫酸钠、乙酸：国药集团化学试剂有限公司（均为分析纯）；三氯乙酸、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸：南京化学试剂有限公司（均为分析纯）；麦芽糖（生物试剂）：沪式试剂有限公司。右旋糖酐酶：KQ11在25℃，200 r/min，发酵28h，经离心，上清即为粗酶液；KQ11发酵培养基配方：酵母粉（1.0 g/L）、蛋白胨（5.0 g/L）、MgSO4（0.4g/L）、NaCl（4.0 g/L）、右旋糖酐20 000（10.0 g/L），蒸馏水配置，用NaOH溶液调整pH值至7.5。

MULTIFUGE X3R高速冷冻离心机：美国赛默飞公司；梅特勒台式pH计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；YP2001电子天平：上海精密科学仪器有限公司；AP-01P真空泵：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；Bio-Rad全自动酶标仪：美国Bio-Rad有限公司；UV9000紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器责任有限公司；DK-8D型电热恒温水槽：上海一恒科技有限公司；NDJ-1型旋转式粘度计：上海天平仪器厂；Brason超声仪：必能信超声（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐含量变化

将榨好的甘蔗汁在室温下暴露于空气中，自然发酵10 d，每天用高速冷冻离心机将甘蔗汁以20 000 g离心20 min，测定上清右旋糖酐含量。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 pH值对右旋糖酐清除的影响

量取400 mL甘蔗汁样品，平均分装到8支锥形瓶中，测定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH或HCl将pH 值分别调节至 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液，45℃水浴保温10 min，取出后置于沸水中2 min灭活右旋糖酐酶，冷却至室温后测定各组样品右旋糖酐含量，用公式（1）计算右旋糖酐清除率。

1.2.2.2 反应温度对右旋糖酐清除的影响

量取400 mL甘蔗汁样品，平均分装到8支锥形瓶中，测定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH调节甘蔗汁pH值至6.0，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液。设置水浴温度分别为35、40、45、50、55、60、65、70℃，保温10 min。之后操作与1.2.2.1同。

1.2.2.3 反应时间对右旋糖酐清除的影响

量取400 mL甘蔗汁样品，平均分装到8支锥形瓶中，测定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH调节pH值至6.0，按每毫升甘蔗汁加入0.1U的右旋糖酐酶液。置于 45 ℃水浴锅中分别水浴中保温 5、10、15、20、25、30、35、40 min。之后操作与 1.2.2.1 同。

1.2.2.4 酶添加量对右旋糖酐清除的影响

量取300 mL甘蔗汁样品，平均分装到6支锥形瓶中，测定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH调节pH值至6.0，按每毫升甘蔗汁分别加入0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.2 U的右旋糖酐酶液，置于45℃水浴中保温10 min。之后操作与1.2.2.1同。

1.2.3 正交试验

在单因素试验的基础上，采用正交试验对右旋糖酐酶清除甘蔗汁中右旋糖酐最佳反应条件进行优化，正交试验表见表1。

表1 L9（34）正交试验表Table 1L9（34）horizontal orthogonal experiment

1.2.4 超声对清除右旋糖酐的影响

1.2.4.1 超声时间

量取甘蔗汁样品200 mL，测定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH调节pH值至6.5，平均分装到4支锥形瓶，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液，置于超声波仪中，反应温度50℃，功率300 W，分别超声1、5、10、15 min，之后操作与 1.2.2.1 同。

1.2.4.2 超声功率

量取甘蔗汁样品150 mL，用快速扫描检测法测定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH调节pH值至6.5，平均分装到3支锥形瓶，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液，置于超声波仪中，反应温度50℃，超声功率分别设置为 200、400、600 W，超声/间歇时间 3 s/3 s，准确超声15 min。待蔗汁温度降至25℃，测定其黏度，操作同1.2.1。之后操作与1.2.2.1同。

1.2.5 右旋糖酐含量测定

采用快速扫描检测法[16]。右旋糖酐能够与无水乙醇作用，在OD720处有最大吸收峰。用右旋糖酐标准溶液测定并绘制右旋糖酐标准曲线。以右旋糖酐含量（C：mg/L）对吸光度（A）进行线性回归，回归方程为：A=0.001 8C+0.006 7（R2=0.999 6）

1.2.6 右旋糖酐清除率的计算

1.2.7 酶活测定

采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法绘制麦芽糖标准曲线，并测定待测样品酶活。以麦芽糖的含量（C：mg/mL）对吸光度（A）进行线性回归，回归方程为：A=0.499 5C+0.064 4（R2=0.999 2）。

1.2.8 黏度测定

将待测甘蔗汁加入到NDJ-1型旋转式黏度计的0号转子中，保持温度在25℃稳定后，启动黏度计使转子转速在60 r/min，观察黏度计表盘读数，将读数代入公式 η=κ·α，式中：η 为绝对黏度，mPa·s；κ 为黏度系数；α为指针所指读数。分别测定最优条件处理前与处理后蔗汁的黏度。

2 结果与分析

2.1 右旋糖酐含量变化

室温下（25℃）甘蔗汁中右旋糖酐含量的变化见图1。

如图1，在室温下（25℃），微生物会消耗蔗糖生成右旋糖酐，右旋糖酐含量平均每天增加8.67 mg/L，平均每天增长率为4.3%。这会导致制糖企业在生产过程中糖回收率降低，产品质量下降。

2.2 单因素试验

2.2.1 pH值对右旋糖酐清除的影响

本试验中，酶剂量0.1 U/mL甘蔗汁，反应温度45℃，反应时间10 min。在pH 4.5～6.0，右旋糖酐清除率稳定而缓慢增加，当pH值高于6.5时，右旋糖酐清除率显著下降，见图2。

图1 室温下甘蔗汁中右旋糖酐含量的变化Fig.1 Changes of dextran content in sugarcane juice at room temperature

图2 pH值对右旋糖酐清除率的影响Fig.2 Effect of pH value on the ratio of hydrolysis of dextran

新鲜甘蔗汁的pH值为中性，微生物生长则造成甘蔗汁中右旋糖酐含量增加和pH值降低，制糖企业中，甘蔗汁进行过滤澄清之前，pH值为5.0～6.0[5]。微酸条件不影响氧化节杆菌KQ11右旋糖酐酶对右旋糖酐的清除作用。

2.2.2 反应温度对清除右旋糖酐的影响

反应温度为35℃～60℃，右旋糖酐清除率相对稳定，在45℃时，达到最高，清除率为81.4%。反应温度高于65℃时，右旋糖酐清除率迅速下降，见图3。

当反应温度高于65℃时，右旋糖酐酶变性失活，然而，甘蔗汁存放以及早期处理过程的温度为20℃～40℃。氧化节杆菌KQ11右旋糖酐酶可满足制糖工艺中甘蔗汁前处理阶段的温度要求。

2.2.3 反应时间对清除右旋糖酐的影响

反应时间对右旋糖酐清除率的影响见图4。

如图4，在5 min～40 min反应时间内，右旋糖酐清除率保持稳定，反应5 min，右旋糖酐酶即可有效清除甘蔗汁中的右旋糖酐。淡紫色拟青霉（Paecilomyceslilacinus）右旋糖酐酶在30℃，反应24 h，可清除70%的右旋糖酐[15]，而本研究所用的右旋糖酐酶反应5 min即可达到70%的清除率，极大节约了时间成本。

2.2.4 酶剂量对清除右旋糖酐的影响

酶剂量为0.02 U/mL～0.10 U/mL甘蔗汁时，随着酶剂量增加，右旋糖酐清除率不断提高。当酶剂量为0.1U/mL甘蔗汁时，右旋糖酐清除率最高，达到80.15%，见图5。

最优的酶含量可加速酶解反应，但是当继续增加酶的含量时，水解率不会进一步提高。甘蔗汁的黏度可能阻止了右旋糖酐酶与底物的相互作用。

图3 温度对右旋糖酐清除率的影响Fig.3 The effect of temperature on the ratio of hydrolysis of dextran

图4 反应时间对右旋糖酐清除率的影响Fig.4 The effect of reaction time on the ratio of hydrolysis of dextran

2.3 正交试验

正交试验结果分析见表2。

根据表2的极差分析，影响右旋糖酐水解的因素主次为酶剂量＞反应温度＞pH值＞反应时间。右旋糖酐酶水解甘蔗汁中右旋糖酐的最优条件：酶剂量0.10 U/mL甘蔗汁、pH 6.5、反应温度50℃、反应时间20 min。在该条件下，可以清除甘蔗汁中83%的右旋糖酐。因此，海洋细菌KQ11右旋糖酐酶在制糖工业中具有应用潜力。

图5 酶剂量对右旋糖酐清除率的影响Fig.5 The influence of enzyme dosage on the ratio of hydrolysis of dextran

表2 正交试验结果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment

2.4 超声对清除右旋糖酐的研究

超声时间对右旋糖酐清除率的影响见图6。

图6 超声时间对右旋糖酐清除率的影响Fig.6 The influence of ultrasonic power on the hydrolysis of dextran

由图6可知，超声处理对右旋糖酐酶清除右旋糖酐的效果十分显著。在酶剂量0.10 U/mL甘蔗汁，pH 6.5，反应温度50℃，超声功率300 W的条件下处理1 min就可清除81.3%的右旋糖酐，当在该条件下处理5 min，清除率达到了85%，比正交试验的最优条件清除率更高，所用时间更短。当超声辅助处理15 min，右旋糖酐清除率达到87.1%，比正交试验的结果提高了4.1%。超声功率对右旋糖酐清除率的影响见图7。

图7 超声功率对右旋糖酐清除率的影响Fig.7 The influence of ultrasonic time on the hydrolysis of dextran

如图7所示，超声功率对清除右旋糖酐的影响非常明显。600W处理15min时的清除率远高于200W和400 W，为88.7%，比正交试验的清除率提高了5.7%。经检测，此时甘蔗汁黏度为4.0 mPa·s，而处理前甘蔗汁粘度为5.0 mPa·s，降低了20%。超声能够促进右旋糖酐酶与底物的结合，而不影响酶的活性[5]。建议在甘蔗制糖企业的前处理工序安装超声变幅杆。

3 结论

海洋氧化节杆菌KQ11右旋糖酐酶能够清除甘蔗汁中右旋糖酐。清除右旋糖酐的最优条件如下：酶剂量0.1 U/mL甘蔗汁、pH 6.5、反应温度50℃、反应时间20 min。在该条件下可以清除83%的右旋糖酐。超声可以提高右旋糖酐清除率。在酶剂量0.10 U/mL甘蔗汁、pH 6.5、反应温度50℃、超声功率600 W、超声时间15 min的条件下，右旋糖酐清除率可达到88.7%，甘蔗汁粘度降低20%。目前商业化的右旋糖酐酶主要来自国外进口，价格昂贵。一些研究者通过甲醇诱导毕赤酵母工程菌获得外源右旋糖酐酶。但是甲醇是易燃易爆物，存在安全隐患，而且甲醇具有毒性，作为诱导剂加入发酵液会在产物中残留，增加处理和检测成本。海洋细菌KQ11发酵简单，生产安全，无需加入有害诱导剂，对环境温和。海洋细菌KQ11右旋糖酐酶与超声联合使用的方法在清除甘蔗汁中右旋糖酐的效果上有着明显优势，安全无害，清除率更高，作用时间更短。建议在糖厂制糖压榨甘蔗汁阶段可使用海洋细菌KQ11右旋糖酐酶，同时安装超声变幅杆，增设超声处理。本研究为右旋糖酐酶在制糖工业上的应用提供了参考。