乳铁蛋白分离纯化研究进展

张基亮，张兰威，2，*，韩雪，马莺

（1.哈尔滨工业大学化学与化工学院，黑龙江哈尔滨150001；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266100）

乳铁蛋白（lactoferrin，Lf）早在1939年就被分离得到，是一种“红色蛋白”，随后对其研究表明，该蛋白的分子量大约为80 kDa，是一种非血红素转铁蛋白，与血清转铁蛋白、卵转铁蛋白和黑素转铁蛋白共同组成了转铁蛋白家族。Lf是由人、牛、羊和马等的上皮细胞分泌产生，多存在于乳和泪等分泌物中[1]。研究发现，Lf是一种多功能性的糖蛋白，其生物学性质包括抗微生物性、抗炎性、抗癌性、免疫调节性和酶活性等[2]。因此，Lf被广泛应用于保健食品、配方奶粉、医药等领域中。Lf既可以来自乳汁，又可以来自工业废液乳清。由于Lf的含量少，需求量大，所以高效分离纯化对于Lf的应用有着重要的意义，也是解决限制其应用的瓶颈。

1 乳铁蛋白的分离纯化的传统方法

纯化Lf的方法有许多种，许多生产公司选择阳离子交换色谱系统来大范围的获得Lf。对Lf的分离纯化开始于上世纪80年代，许多公司都致力于开发获得高纯度Lf的工艺。据估计，世界的牛Lf的产量超过60 t/年[3]。对Lf分离纯化方法从最初的阳离子交换到亲和层析再到免疫学方法，以及各种方法的组合对于分离及纯化Lf都各有利弊。

1.1 阳离子交换色谱

利用阳离子交换色谱从原料中分离获得Lf是传统的方法，其优点是操作简单、步骤少、持续进样和容易扩大等优点。但是，传统色谱层析用于快速的和大量的从乳清蛋白中回收Lf时表现出很多的缺点，如色谱层析材料的污染、循环时间长、液滴通过色谱柱时压力大以及复杂的控制系统，而且原料中许多与Lf带有相同电荷及相似等电点的杂蛋白在分离纯化Lf时被一同洗脱下来，所以获得的Lf纯度低、费用昂贵和相对低的产量。造成这些缺点的原因是用于分离的乳清体积大和蛋白浓度高导，使其单独应用于Lf的回收时受到限制。然而，与其他方法的结合可以部分解决其限制因素[4]。

Conan J Fee等[4]用XK16色谱柱和琼脂糖凝胶填料，以全脂乳或未经任何处理的原料乳为原料，一步法同时获得Lf及乳过氧化物酶（lactoperoxidase，Lp），且最佳的吸附能力为48.6 mg/mL。

1.2 膜吸附

膜吸附技术通过过滤吸附过程为从乳清中回收蛋白提供了一个可能性。该技术通过将色谱分离和过滤相结合，可以将具有功能性的基团附着到大孔膜的内部表面，使膜转换成高效的吸附材料。因此，根据不同的需要选择不同的功能性基团来达到不同的分离目的，如离子交换和配体系统等。商业上可用于实验室和大规模的膜系统是离子交换系统和强酸型（磺酸）、强碱型（季铵）、弱酸型（羧酸）和弱碱型（乙二胺）[5]。现在用于工业化生产的膜吸附技术被设计成了二次过滤和浓缩方法的结合。然而，这个过程需要极其大量的水来有效的分离生物大分子，产品的回收率取决于缓冲液的体积，而且不能区分分子量相似的蛋白。因此，使得该技术在分离纯化蛋白时步骤多、回收率低、另外不同组成的乳清蛋白使得纯化过程的预测性变得复杂、选择性低和随时间延长的膜堵塞等缺点[6]。

为改善膜技术的诸多不利，切向流过滤膜被开发出来，该技术是基于交叉流体动力学，由于在每个膜上所需的底板面积小，减少了压力驱动力并且降低了渗透通量，整个操作所需的压力更低。因此，可以降低膜堵塞的程度，延长使用时间从而达到快速分离的目的[7]。由于Lf的热稳定性差，而膜分离是一个不需加热，没有相变并且不需要化学试剂的分离过程。因此，该方法可以最大限度的保持Lf的生物活性，使之成为分离回收Lf的一个优势。

Kerstin Plate等[5]研究是否能利用膜技术将乳清中Lf回收以及实验室水平的设备是否可以直接应用于工业化。试验用的膜面积从15 cm2上升到4 m2，其试验结果表明，最佳条件是选用Sartobind S系统，膜面积扩大到2 m2，8个循环不用清洗。Almécija等[8]使用300 kDa的陶瓷微孔膜从乳清中分离Lf，研究表明，获得Lf最佳的溶液pH值分别为pH 5和pH 10，前者可以获得Lf，而后者可以使Lf滞留在原乳清中。为了克服膜吸附无法区分近似分子量的弊端，Brisson等[9]使用荷电膜和电场的结合，电场使蛋白的移动起到了重要的作用，虽然解决了一部分纯度问题，但是溶液表面发生的电解反应对于Lf的分离起到了负面的影响。

1.3 胶质气体泡沫

胶质气体泡沫（colloidal gas aphrons，CGAs）由表面活性剂溶液强烈搅拌由气体内部核心所围成的微泡，通过静电相互作用和疏水相互作用吸附分子。其在分离生物大分子上具有很好的特点，诸如：（1）由于其体积小而具有大的界面面积；（2）相对稳定，当其形成后，一旦停止搅拌，CGAs在不需要外力的帮助下数分钟内分离成两相；（3）表面特点和吸附的选择性可以通过改变表面活性剂的类型而改变。研究发现，离子型表面活性剂比非离子表面活性剂具有更高的蛋白富集和回收效果[10]。

E Fuda等[10]研究分离乳清蛋白时发现，阴离子表面活性剂双（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠（sodium bis-2-ethylhexyl sulfosuccinate，AOT） 形成的 CGAs适用于分离乳清中的Lf和Lp，而通过改变pH值和等电点可以使Lf和Lp分散在上层的泡沫相和下层的液相中，实现蛋白分离的目的；而阳离子（溴化十六烷基三甲铵）胶质气体泡沫适用于分离乳清中的β-乳球蛋白，其中静电相互作用是决定选择性的主要作用力。该技术具有可连续操作、表面积大、可通过改变表面活性剂的类型所修饰、相对稳定性高和分离时间短等特性，但选择性相对较低。

1.4 模拟移动床

模拟移动床是基于模拟一个真正的在固相和液相之间反流操作。通过阀门间的切换使柱子间像木马一样换位。反流操作使得吸附剂的使用更有效并且液体流会带来许多优势，如高生产率、费用低、分离装置小、产品浓度高、减少缓冲液的消耗、对原材料的使用效率更高和高纯度产品是其的一些优势，其中最吸引人的优势是可以使用不经离心去脂肪的原料奶。其弊端是不同的对象需要不同相关的流速，并且流速非常缓慢；另一个弊端就是由于各柱间一系列的连接使得比普通的色谱液体压力大很多，其数学模型太复杂，不易弄明白[11]。

Jonatan Andersson等[11]利用此技术对Lf的试验结果表明，相对无移动床过程来说，移动床在生产效率上提高了48%，节省6.5倍的缓冲液，目标蛋白的得率提高4.8倍。

1.5 电分离

电分离技术是利用分子大小和其自身所带电荷的不同对蛋白分子进行分离的技术，电流可以使得分离速度加快。与传统压力驱动方法相比，电场的应用的优势在于提高了Lf分离的速度，但同时降低了其纯度，原因是由于在分离Lf的同时其他乳清蛋白的迁移和蛋白间相互作用。电分离与微滤膜结合可以克服低选择性和溶液污染等不足。

N Ndiaye等[12]利用此方法对Lf进行了分离，Lf的最佳分离条件为pH 3.0，以2 g/L的KCl溶液为溶液时，其最佳条件为1.5×10-8m2/（V·s）；以去离子水为溶液时，其最佳条件为3.0×10-8m2/（V·s）。结合500 kDa的超滤膜，经过4 h的处理后，迁移率达到46%，产量为15%。该方法的不足是，在pH 3.0的时候，β-乳球蛋白也会一同被分离出来。

2 乳铁蛋白的分离纯化的新方法

由于Lf的广泛应用，人们对其纯度的要求越来越高，但乳清中的一些蛋白如乳过氧化物酶，该蛋白和Lf具有相似分子量和等电点。另外，一些学者还指出Lf结合蛋白在纯化Lf的同时也被纯化，其中包括核糖核酸酶-4、血管生长素、嗜中性粒细胞凝胶酶相关钙脂蛋白和成纤维细胞生长因子结合蛋白等。这些微量蛋白与Lf可能涉及到许多Lf体内功能多样性的生理学活性[13]。常规的疏水相互作用、亲和色谱、分子排阻、超滤和膜超滤等过程复杂，加之选择性低，因此一些选择性高的方法被开发出来。

2.1 羟磷灰石法

Paul K Ng等[14]使用一种混合模式色谱-陶瓷羟磷灰石层析。该方法可以一步将乳清中的Lf、Lp和其他球蛋白都分离，然后通过梯度洗脱获得Lf。试验结果表明，一个80 L的羟磷灰石柱一小时可收集0.32 kg的Lf，得到的Lf经验证不含任何的Lp活性。产量高、费用低和步骤简单使得该操作具备所有的用于有效地大规模生物技术产业特点。羟磷灰石纯化过程需要大量的水来有效地分离大分子，产品回收率依赖于使用缓冲液的量、该方法没有办法区分具有相似水合粒径的分子，因此产品的纯度可能会受到影响。另外，乳清中不同的蛋白间相互作用使得该过程很难预测。

2.2 噬菌体蛋白-亲和色谱

亲和柱一般是基于抗原抗体反应，具有特异结合的配体被广泛应用于不同的分离纯化目的。亲和柱的选择性高有利于获得纯度高的蛋白，然而配体本身昂贵、根据分离不同的目的蛋白，配体本身需要重新进行筛选和纯化、配体的易碎性降低了柱的使用寿命、配体降解导致终产品的污染以及染料配体的泄露和毒性问题是限制其应用的原因。

噬菌体作为多肽配体的表达者，其谱库量大并且针对诸如Lf、胰岛素和血清白蛋白等的噬菌体已经成功的被选育。亲和色谱中的肽配体可以用常规的方法或者固相直接合成法固定于基质上，用于目的蛋白的分离纯化。人工合成的多肽与宿主表达的多肽往往表现出不同的性能，因此Wim Noppe等[15]成功选育出了4株表达能够结合Lf六肽的噬菌体，然后将长度1 μm噬菌体直接固定化到大孔基质上用于Lf的分离纯化。其试验表明，利用该亲和方法可以一步法提取Lf，且其纯度高于95%。该方法的优点是基质孔洞不易堵塞、操作过程简单、可持续性、回收速度快。且噬菌体表达相比单克隆抗体要便宜及步骤简单。

2.3 磁性纳米粒子

磁性纳米粒子用于分离Lf的好处在于，当外加电场时，磁性纳米粒子瞬间带有磁性，可以在电场作用下泳动。当撤去外加电场时，磁性立即消失，这样有利于磁性纳米粒子的分离，再配合以膜等技术，最终获得目的蛋白。

Bo-Hung Lai等[16]将伴刀豆蛋白A结合在Fe3O4磁性纳米粒子上，获得了平均直径为（11.74±3.86）nm的近超顺磁性粒子。经过试验证明，该粒子在分离Lf时的最佳条件为pH值=7，温度25℃，平衡时间在5 min之内，最大吸附能力和平衡常数分别是59.2 mg/g和0.010 3 L/mg。

Lin Chen等[17]以肝素作为亲和配体，用磁性亲和方法分离Lf，肝素在对于Lf的结合能力为0.92 mg/g。试验以NaCl作为洗脱液，通过一步法非常高效地从酸性乳清中回收Lf，最高的结合能力是164 mg/g。且获得的Lf的纯度要高于商业标准。通过对比竞争吸附试验证明磁性方法是一种潜在的能够快速和大规模生产方法。

2.4 离子液体-水两相系统

离子液体-水两相系统为新颖的分离过程可以克服常规分离和纯化Lf技术的限制，其组成特点是通过散装膜与U型管的组合来完成试验用的分离装置，U型管的一侧上方为水相，含有待分离的目的蛋白；另一侧上方为水相；U型管的底部为离子液体相，离子液体相与水相之间用膜分隔开。使蛋白通过相转变而完成分离工作。离子液体-水两相系统的优点是，温和的相容性环境、提取率高、相分离快速和相对低的黏性；缺点是容易互溶，使得分离和回收离子溶液变的复杂。

Enrique Alvarez-Guerra等[18]利用两种咪唑类作为离子液体进行研究，分别为1-丁基-3-甲基咪唑双[（三氟甲基）磺酰基]酰亚胺（1-butyl-3-methylimidazolium bis[（trifluoromethyl）sulfonyl]imide，BmimNTf2）和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，BmimPF6）。试验结果表明，最高效的试验条件为：蛋白浓度含量为100 mg/L、pH 6.4～8.2和低离子强度0.03 mol/L时提取率达到20%。最好的粒子液体为BmimNTf2，原因在于，虽然BmimNTf2的分离效果没有BmimPF6的效果好，但前者较后者更加稳定、不易溶于水以及对牛血清白蛋白的吸附能力极小，因此前者更利于Lf的分离。

3 方法的结合

3.1 阳离子交换与膜结合

在使用阳离子交换或膜分离Lf时，由于阳离子交换不能区分相似pH值的蛋白质以及膜分离不能区分相似分子量蛋白的影响。因此，使两种方法单独使用时获得的Lf的纯度不高。二者联用同时减少了两者分离蛋白的局限性。

吸附膜的准备一般分为3步，基本膜的准备、化学激活基本膜和连接配体激活膜。后2步需要强烈的化学试剂和物理情况可导致不希望的及不可逆的膜结构变化。而混合基质膜色谱是一个理想的替代，由离子交换树脂在膜铸造前合并到高分子膜内，因此合并吸附配体化学修饰的必要性与膜准备过程不偶联。

Mian bin Wu等[19]利用色谱和膜结合的方法可以同时分离Lf和免疫球蛋白G，并且纯度分别是95.0%和96.6%。但回收率相对较低分别为68.83%和45.38%。

Syed M Saufi等[20]通过将SP Sepharose阳离子交换树脂嵌入到乙烯-乙烯醇聚合物膜中来提取Lf。该技术对静态Lf结合能力为384 mg/g或者155 mg/mL。Lf的纯度可达到91%，进样速率50 L/（m2·h），运行的渗透通量率为100 L/（m2·h），整体柱中物质传输主要是依据对流，短的整体柱可以提高分离速度的同时降低反压、非特异性结合、产物降解等。

Lu等[7]通过超滤牛初乳分离得到Lf，然后通过快流速的阳离子交换色谱系统将其纯化。其中超滤过程由两部分组成，第一部分由常规的100 kDa截留的膜配合以5 m/s的切向流速组成，第二部分则是将膜截留的分子量换成10 kDa配合4 m/s的切向流速。通过该种方法的组合，最终获得Lf的纯度为94.20%，Lf的回收率为82.46%。

3.2 液相色谱与膜结合

膜色谱用于蛋白纯化是将膜过滤和液相色谱整合到一起，进而形成一步的操作步骤。膜色谱比传统树脂色谱的优势主要在于其扩散时间短，因为分子间和膜上活性位点间的相互作用在孔之间是通过对流作用发生的，而不是传统的吸附粒子孔中的滞留液体作用。因此，膜色谱既可用于高流量又可用于低扩散度的生物大分子，同时还可以减少大分子降解和变性。另外，由于其液压低以及流速快，减少其在分离纯化过程中所用的缓冲液量[21]。

研究报道，使用该结合方法从甜乳清中分离Lf，Lf分别通过0.1、0.2、1 mol/L NaCl洗脱获得，其纯度可以达到95%。将该膜面积从15 cm2增加到4 m2后，可以使Lf的回收率达到90%以上。但本身存在一个缺点，当将流速从3 mL/min提高到15 mL/min时，其结合能力从0.6 mg/cm2下降到0.3 mg/cm2[21]。

4 结论

Lf纯化的研究取得了相当大的进步，由于Lf的含量极少，且组成乳的蛋白种类较多，想要低成本的获得高纯度的Lf还需要近一步的研究，希望本文会对今后Lf的分离纯化给予更多的新思路。