黄曲霉毒素降解技术及其降解产物研究进展

莫紫梅，袁光蔚，陈宁周，郑娟梅，王警，王海波

（广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西南宁530021）

黄曲霉菌及其代谢产物黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT）可诱发肝癌、乳腺癌等，严重威胁人类的健康，还会对粮食作物、水产、畜牧、养殖业等造成巨大的经济损失[1]。粮食作物在生产、加工及流通过程中极易受黄曲霉菌及其代谢产物黄曲霉毒素的污染。广西由于处于亚热带季风气候区，气候温暖，热量丰富，雨水丰沛，大部分地区年降雨量为1 500 mm～2 000 mm，这种高温高湿的环境使花生、大豆等粮食作物更易受到黄曲霉菌及其代谢产物黄曲霉毒素的污染。有些食用油小作坊生产制作的食用油，在原料采购、运输、保存到生产制作各个环节，由于缺乏相应的技术水平或者安全意识，制作的食用油存在黄曲霉毒素污染的情况不容忽视。因此，探索一种有效降解黄曲霉毒素的方法，成为迫切需要解决的问题。

目前，黄曲霉毒素降解脱毒主要有物理法、化学法和生物技术法，本文对黄曲霉毒素的降解技术以及降解产物的研究进展进行综述，并对该领域进一步研究提出看法，为推动黄曲霉毒素降解应用，寻求建立一种高效、快捷、安全处理黄曲霉毒素的新方法提供参考。

1 黄曲霉毒素的降解技术与降解产物解析

黄曲霉毒素的脱毒途径是将毒素降解为无毒的小分子物质、把毒素转化成无毒化合物等方式。常规的脱毒方法主要有化学法、物理法、生物法和转化解毒等[2]，其特点见表 1[3-5]。

1.1 物理降解技术及降解产物

1.1.1 辐照

辐照降解毒素的原理是利用电离辐射产生的高能射线使分子结构发生变化，从而改变其原有的生化特性，主要是通过发生加成反应、消去反应等转变成为无毒或低毒的中间产物[6]，或者破坏其中的物质结构，实现毒素的降解[6]。目前主要有紫外线辐照、60Co、137Cs产生的γ射线、电子束等用于生物毒素的脱毒研究[7]，特别是AFT的脱毒。不同的脱毒方式，用于不同介质中AFT的降解，会产生不同的降解产物。

表1 脱毒技术特点[3-5]Table 1 The characteristic of detoxification technology

微波降解AFT是由于电磁振荡效应诱导AFT发生降解，降解产物的毒性结构二氢呋喃环双键被破坏[8]，微波辅助碱法降解稻米中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）后降解产物，经超高效液相-四级杆串联飞行时间质谱仪（ultra-performance liquid chromatography quadruple-time-of-flight mass，UPLC Q-TOF MS） 技术发现有 m/z 319.081 3、341.055 9、283.061 0、301.063 4、347.076 2等降解产物[8]。

电子束亦被学者用于黄曲霉毒素降解的研究，不同介质中的AFT，其降解行为、降解产物及路径会有区别。花生粕经过电子束照射后，其中的AFB1会发生强烈的辐解反应，迅速引发了AFB1分子的氧化反应，使其断裂成为一些不具有紫外吸收信号的小分子物质，而水中的AFB1经电子束照射后，其降解产物则为D1（C16H12O7）、D2（C16H16O6）、D3（C17H14O8）、D4（C15H12O6）、D5（C17H12O7）等 5 种，D2、D4 分子量小于 AFB1母核分子量，可能是分子结构发生基团断裂现象，D1、D3、D5分子量大于AFB1母核分子量，可能是分子结构断裂后又发生聚合反应，其降解过程是AFB1在C（6a）-O（7）处发生分子间氢提取反应，并在 C（1）-C（2）和 C（3）-C（3a）处发生消去反应生成 D4，AFB1在 C（8）-C（9）处发生加成反应生成D3，D3再发生消去反应、还原反应等生成D1、D2和D5，降解产物结构与AFB1类似，只在部分基团稍有不同[9]。

利用γ射线辐照AFB1研究目前主要应用在水溶液以及甲醇水溶液中，其降解机理遵循自由基反应机制[10]。不同介质中的AFB1经γ射线辐照后，由于在AFB1母核分子不同位置发生加成、重排、消去、取代等反应，则会产生很多不同的辐解产物。如甲醇-水体系中检测到25个辐解产物，其产物分子式主要有A1（C17H14O7）、A2（C16H10O5）、A3（C14H10O6）、A4（C18H16O8）、A5（C16H14O7）、A6（C17H14O8），水溶液的降解产物主要有A1（C17H14O7）、A7（C17H12O7）、A8（C16H12O7）、A9（C16H10O6）。其可能的机理是：A1的不饱合度（double bond equivalents，DBE）排序为11，不饱合度较AFB1小1，说明AFB1的C8-C9位双键可能发生了OH和H的加成反应；A2的DBE、不饱合度与AFB1相同，则表明AFB1在辐照过程中其苯环侧链上脱甲氧基形成的；A3的DBE、不饱合度与AFB1相同，推断是AFB1在辐照过程中，失去甲基，且伴随一个呋喃环被分解，呋喃环中氧经过重排在五碳环被加成成为含氧的六碳环；A4的DBE排序为11，不饱合度较AFB1小1，表明AFB1呋喃环左侧双键发生了加成反应；A5的DBE、不饱合度均比AFB1小1，表明呋喃环左侧双键发生了加成反应，有OH和H的加成，且分子结构中缺少1个C，说明苯环侧链的甲氧基被羟基取代[10]。

目前，紫外光照射在AFB1降解中的研究较多，而紫外光照射后产生的降解产物跟AFB1所处的介质、紫外光强度、照射时间等有关。乙腈体系中AFB1紫外光降解产物有 A（C14H10O6）、B（C17H14O6）、D（C16H13O5）等，其机理是C（AFB1）物质通过分子间氢提取反应生成 B（C17H14O6），接着在 C（9c）-O（10）位发生光加成反应，在 C（6a）-C（9a）处发生光消去反应，生成较稳定的A（C14H10O6）物质，D（C16H12O5）产物则由 AFB1母核在 C（11）-O（15）发生光消去反应生成[11]，见图 1。

AFB1在水中的紫外光降解过程则是由AFB1的C（8）-C（9）位发生加成反应生成中间产物P1（C17H14O7），P1在 C（1）-O（14）位发生的光还原和 C（4）-O（12）发生的光消去反应形成P2（C16H14O6），同时P1在C（12）-O（13）位发生的光消去反应产生P3（C16H12O7），见图2。

花生油中AFB1的紫外降解产物，得到2种可能的降解产物：F1（C18H33N3O3）和 F2（C12H22N2O2），这两种产物的产生可能是由于AFB1分子结构中呋喃环末端双键和内酯环发生取代和裂解反应形成的，并与花生油中的某些小分子化合物发生反应形成的，其具体过程可能如下：由于AFB1的分子结构中内酯环部分是不稳定的，在外界条件的影响下，会脱去羰基，丢失-CO，花生油经紫外照射后，其中的含氮化合物会发生裂化反应形成R-NH2、-NH2等小分子化合物，这些小分子化合物在AFB1结构的活性位点-右侧五元环和呋喃环上可以发生加成和取代反应，一些-OH基团被-NH2基团取代，形成C16H14O4，再通过氢加成反应和一系列复杂的化学变化后，形成C19H33N3O4，然后丢失一个-OCH3产生F1，而F2可能是F1中的五元环裂解后形成的[12-13]，见图 3。

图1 乙腈溶液中AFB1可能的降解途径Fig.1 The possible degradation way of AFB1in acetonitrile solution

图2 水中AFB1可能的降解途径Fig.2 The possible degradation way of AFB1in water solution

1.1.2 热处理法

热处理对AFB1具有一定的降解作用。郑海燕[14]研究报道20 mg/L的AFB1经120℃处理后，热降解效果不明显，经210℃处理后，降解率可达93.8%，利用UPLC-Q-TOF-MS分析出AFB1在甲醇水溶液体系中的降解产物有C17H14O7和C18H16O7，降解产物的双键被加成，不饱合度降低。常敬华[15]分析了面包加工过程中还原性添加剂对脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）毒素的影响，结果表明，面团发酵结束后，其DON毒素含量变化不明显，烘烤后面包皮中DON毒素含量则降低7.9%～15.1%，而面包囊肿DON毒素含量则降低7.4%～17.1%。朱涛等[16]考察了干燥方式对土鳖虫黄曲霉毒素含量的影响，结果表明，土鳖虫黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黄曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黄曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）、黄曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）含量与温度及干燥时间有关。

图3 花生油中AFB1可能的降解途径Fig.3 The possible degradation way of AFB1in peanut oil

1.2 化学降解技术及降解产物

化学脱毒是采用酸处理、碱处理和氧化剂处理等能与生物毒素发生化学反应，破坏其化学结构，从而降低或消除其毒性的一种方法。

碱处理是使生物毒素分子结构中的内酯环被打开进而形成盐，分子结构发生变化，导致毒性降低或者消失。罗小荣等[17]采用1%碳酸氢铵溶液和2%～5%氨水对莲子进行清洗，发现两者对黄曲霉素的去除率可达90%以上，是由于碳酸氢铵水溶液呈碱性，易分解为二氧化碳、氨和水；氨与AFB1发生脱羟作用，导致其内酯环发生裂解，达到脱毒目的。甲醇体系中AFB1在NaOH溶液作用下的降解产物可能是C12H11O2K，是由AFB1的双呋喃环被完全破坏，氧杂萘邻酮的内酯结构也脱掉了一个CO2基团，如图4。

图4 AFB1在氢氧化钠处理中的降解途径Fig.4 The possible degradation way of AFB1treated by NaOH

NaHSO3处理下的降解产物可能是C16H13O5，是由AFB1母体第一个呋喃环断裂失去一个羰基形成[18]，见图5。

图5 AFB1在亚硫酸氢钠处理中的降解途径Fig.5 The possible degradation way of AFB1treated by NaHSO3

化学氧化剂通过改变生物毒素的功能基团改变其毒性，具有钝化黄曲霉毒素的能力。氧化剂能够破坏黄曲霉毒素，具有钝化黄曲霉毒素的能力。常用氧化试剂有过氧化氢、臭氧、次氯酸钠、氯气等。郑燕[18]研究了双氧水浓度对甲醇介质中AFB1的降解效果影响，结果表明，3%双氧水在室温下放置12 h，降解率达55%。利用高分辨质谱研究推断其降解产物为C14H9O4，可能是由AFB1母体第一个呋喃失去-C3H4O2，还有氧杂萘邻酮结构中的六元环上的羰基和苯环上的甲氧基也遭破坏，见图6。

陈冉[19]报道了臭氧对G族黄曲霉毒素的降解效果比B族好，且臭氧对AFG1、AFB2降解效率分别为70%和40%。臭氧降解AFG1的产物有C17H12O10、C18H16O11、C16H10O7、C16H10O10，其机理是臭氧破坏了黄曲霉毒素分子中的C8-C9位双键，最终将其分解为有机酸、醛、酮、二氧化碳等小分子物质，AFB1和AFG1中C8-C9位为不饱和双键，AFG1和AFG2中氧杂萘邻酮部分含有酯基，臭氧易攻击AFB1和AFG1中的C8-C9位双键使其降解。罗小虎[20]利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC Q-TOF MS）对不同臭氧体系下AFB1的降解产物进行结构解析，研究发现臭氧和臭氧水纯体系与AFB1反应的主要降解产物有C16H16O6、C17H14O7、C16H14O5、C15H14O5、C17H12O6、C17H11O7、C17H23O9、C16H13O7、C16H17O6、C17H15O8、C16H15O7。根据产物结构分析，表明在臭氧和臭氧水纯体系中，AFB1降解产物的生成途径AFB1的臭氧加成反应历程，臭氧分子作用为主，其反应机制主要是亲电和亲核机制。研究表明，臭氧通常最先破坏有机物的双键，AFB1中C8-C9双键最容易被臭氧破坏，但仍保留二氢呋喃和香豆素的基本结构。

图6 AFB1在双氧水处理中的降解途径Fig.6 The possible degradation way of AFB1treated by H2O2

1.3 生物降解技术及降解产物

生物技术脱毒是目前的研究热点之一，其机制是通过吸附作用或酶促反应降解毒素或者修饰毒素分子而达到脱毒的目的[15]。通过筛选的生物菌株或降解酶的菌液、分泌胞外酶、发酵液等降解黄曲霉毒素的研究技术已应用于了食品、饲料、制药和环保等领域。崔玉琦[21]筛选出芽孢杆菌E-1-1-1，其在42℃，pH5.5，接种量为3%时对AFM1的降解率可达92.5%。左瑞雨[22]报道了乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌单独培养后以2∶1∶2混合，48h对AFB1的降解率可达82.72%。徐丹[23]报道黑曲霉FS10及其发酵产物对AFB1有较好的降解效果，这种降解酶是一种不耐热的胞外酶，机理是酶促降解。发现AFB1经降解酶作用后荧光强度明显减弱，且产生了分子量为286的物质。推测AFB1的降解途径为：降解酶通过水解作用打开了AFB1的内酯环结构，生成具有β-酮酸结构的中间产物，然后进一步发生脱羧反应，生成了m/z286的物质，使得AFB1的毒性大大减弱。李文明[24]报道了施氏假单胞菌F4 降解 AFB1的研究，F4 悬浮液对 AFB1（5 μg/mL）培养72 h后的降解率达86.6%，培养102 h后检测不到AFB1。利用紫外全扫描确定了AFB1降解产物可能的最大吸收波长为200 nm～210 nm和250 nm～260 nm之间，利用UPLC Q-TOF MS技术筛查出分子量为206.056 4（一级质谱）的降解产物C11H10O6，对此产物的极性、二级质谱碎片（54.984 4、70.979 0、81.032 4、110.974 2）进行结构解析，推导该产物可能的结构式是6-甲氧基-[4，9]苯并-2，10，11，13-四氢-[11，13-环氧乙烷]双呋喃。

2 黄曲霉毒素降解产物的安全性评价

食物中黄曲霉毒素经脱毒技术去除或降解后，其降解产物的安全性评价成了学者们研究的热点内容之一。食物经各种毒素降解技术后的安全性评价可通过食物品质、动物实验来评价。

2.1 食物品质的安全性评价

花生油经紫外光照射后，酸价、过氧化值会显著增加[9，11-12，25]，油酸、亚麻酸、花生一烯酸有所降低[25]，对花生油其他品质并无影响[11]，而花生油经微波处理后，其酸值、碘值、过氧化值、维生素E和反式脂肪酸均未发生显著变化[26]，且AFB1降解产物对细胞基本不产生毒性作用[12]。碱炼脱毒对花生油品质影响很小，碱炼脱毒能改善花生油色泽，会导致花生油酸值、过氧化值升高，但不饱和脂肪酸无显著变化[27]。

学者报道不同功率微波处理后牛乳的蛋白质、脂肪、维生素C含量之间差异极显著，乳糖含量差异不显著[28]。微波处理对稻米中米蛋白的溶解性、起泡性、持油性、体外消化性显著提高，乳化性先提高后下降，持水性呈下降趋势：总巯基、二硫键含量增多，表面疏水性显著性增强，自由巯基含量减少，表明微波辅助处理可能首先诱导部分米蛋白发生聚集形成可溶性大分子聚集体，但随着微波处理时间的进一步延长，米蛋白聚集体发生解聚形成小分子蛋白[8]。

电子束辐照会使花生粕中还原糖、总黄酮、棕榈酸、亚油酸、油酸等含量会有少量增加，花生酸含量降低，粗脂肪、粗蛋白、氨基酸总量等无显著变化[9]；对小麦淀粉和蛋白质分子有破坏作用，导致面粉的耐机械搅拌性和操作性变差，面粉的品质受到影响[29]。

经臭氧处理玉米中AFB1后，玉米水分含量下降，脂肪酸酯明显升高，色泽、黏度和糊化等性能均发生改变[20]，对玉米中脂肪酸成分没有影响，但会影响玉米油中的脂肪酸组成[30]。

2.2 毒理试验的安全性评价

学者们应用Ames和细胞毒理实验研究不同基质中AFB1降解产物的致突变性和细胞毒性，结果表明，经电子束辐照后，水体系中AFB1降解产物的致突变性降低50%以上，细胞活性降低18.61%，花生粕中AFB1降解产物已无毒性[9]；微波辐照降解花生油中AFB1后所产生的降解产物无致突变性，其毒性消失[26]；紫外辐照处理后的花生油无致突变性，HepG2细胞活性达95.54%，说明降解产物毒性降低[25]；AFB1污染的玉米经臭氧处理后，对昆明鼠毒性显著降低，AFB1降解产物对HepG2人肝细胞的凋亡显著减少，血清中主要指标谷丙转氨酶活性、总蛋白、白蛋白和球蛋白含量跟正常组对比无显著差异，肝脏组织有轻微组织学改变[20]；微波辅助碱法降解稻米中AFB1降解产物毒性较AFB1有所降低[8]；臭氧、二氧化氯和微波辅助碱法都能有效降低黄曲霉毒素的致突变性，从而提高花生的食用安全性，但花生油的酸值、过氧化值会有轻微提高，仍低于国家标准规定[31]。

对于生物技术脱毒后的安全性评价，众学者通过动物试验、Ames试验和细胞毒理实验均有报道。动物实验研究证实，芬氏纤维微菌T3-5可降低盲肠大肠杆菌的数量，能改善AFB1对维鸭的生长性能的影响，缓解AFB1对肝脏的损伤作用并使肠道环境趋于正常，当加菌剂量为1×108cfu时对雏鸭肝脏和肾脏无损伤作用[32]。经施氏假单胞菌F4降解的AFB1产物的致突变性显著降低[24]。解淀粉芽孢杆菌N-2对黄曲霉有显著抑制效果，其安全无毒，对胃酸和胆盐有耐受性，且能降低AFB1对动物的毒害作用[33]。

3 展望

黄曲霉毒素毒性巨大，危害严重，南方高温高湿的环境使花生等粮食作物更易受到黄曲霉菌及其代谢产物黄曲霉毒素的污染，因此，食用油乃至食用农产品的黄曲霉毒素的脱毒工作尤为重要且艰巨。传统食用油精炼工艺中采用化学碱液处理法去除食用油中黄曲霉度毒素，但会对油脂色、香、味及营养成分造成不同程度的破坏和影响，而且易带来二次污染。对于同样存在被毒素污染安全隐患的其他食物，为其找寻到一种安全、有效、可行、高效的脱毒方法破在眉睫。对辐解产物的结构、组成及毒性进行分析和安全性评估，建立完善的真菌毒素脱毒降解机制，将是今后一段时期内真菌毒素辐照降解技术研究与应用的重点。