醒脑静注射液对急性脑梗死血瘀证患者外周血单个核细胞T-bet/GATA-3平衡的影响

张 帆,张晨红

(陕西省核工业215医院,陕西 咸阳 712000)

急性脑梗死也称作缺血性脑卒中，是由于脑部血管动脉粥样硬化而导致的血管狭窄以及闭塞，继而出现脑组织缺氧以及缺血性坏死引发的神经系统疾病，临床以血瘀证为主要证型。急性脑梗死的发病过程与炎性反应、自由基增加、钙水平异常升高、细胞凋亡等因素密切相关，而T-bet与GATA-3免疫平衡与该病的关系尚不十分明确[1]。有研究证实，醒脑静注射液用于急性脑梗死的治疗效果较好[2]。故本研究观察了醒脑静注射液对血瘀证急性脑梗死患者外周单个核细胞(PBMC)中T-bet与GATA-3表达情况的影响，期望能够为急性脑梗死的治疗更多参考依据。

1 临床资料

1.1一般资料 选择我院2015年9月—2016年12月收治的急性脑梗死患者80例，均符合《全国第四届脑血管病学术会议纪要》[3]中制定的临床诊断标准，均参照《血瘀证中西医结合诊疗共识》[4]判定为血瘀证，患者均在发病24 h内住院治疗，在发病48 h内意识较为清晰或者存在轻度障碍。排除肝、肾、肺、心存在功能性问题者，合并心肌梗死、糖尿病、心律失常者，合并慢性感染性疾病、脑部肿瘤、免疫风湿性疾病者，CT或者MRI诊断为脑出血与蛛网膜下腔出血者。本次临床研究上报医学伦理委员会获得批准，所有患者及家属均签署知情同意书。随机将80例入选者分为2组：观察组40例，男24例，女16例；年龄45～80(60.73±5.81)岁；发病至入院时间(16.49±5.24)h；存在吸烟史者16例，高血压病史者17例。对照组40例，男22例，女18例；年龄44～82(60.59±5.66)岁；发病至入院时间(16.54±5.33)h；存在吸烟史者17例，高血压病史者18例。2组患者的性别比、年龄、发病时间等资料比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，均衡性较好。

1.2治疗方法 对照组患者在入组后给予抗凝、保护脑神经等常规治疗，其中阿司匹林片(昆明制药集团金泰得药业股份有限公司，国药准字H53021985，规格：0.5 g/片)每晚0.3 g口服，持续服药1周后改为每次0.1 g，阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司，国药准字H20051407，规格：10 mg/片)每晚40 mg。观察组患者入组后在常规治疗基础上给予醒脑静注射液(大理药业股份有限公司，国药准字Z53021636，规格：10 mL/支)30 mL加入0.9%氯化钠注射液250 mL中静脉滴注。2组均持续治疗2周为1个疗程。

1.3观察指标 ①PBMC中T-bet与GATA-3表达情况：分别于治疗前后抽取2组患者的清晨空腹外周静脉血15 mL，在肝素抗凝处理后，以Ficoll密度梯度离心方法提取外周血中的淋巴细胞，分离PMBC，在1640培养液中洗涤2次后重悬制备PBMC。采用RT-PCR法测定PBMC中T-bet mRNA与GATA-3 mRNA表达情况：选择Trizol试剂提取总RNA，采用AMV逆转录酶法合成cDNA，将3μg总RNA加入RT反应体系试管中，RT反应体系包含1 μL的M-MLV、1μL的RNasin、1μL的Random Primers、5 μL的5×MMV Buffer、2.5 μL的4×dNTPs，在试管中以DEPC水补充容量，最终反应液体积为25 μL，在混合均匀后离心处理。在43 ℃的环境下静置30 min，在99 ℃的条件下静置5 min后，保存在-40 ℃的环境中。选择PCR扩增仪测定PBMC中T-bet mRNA与GATA-3 mRNA表达水平，内部参考选择β-actin。引物序列中T-bet的上游引物为5’-CCGTGACTGCCTACCAGAAT-3’，下游引物为5’-TCATGCTGACTGCGCGAAAC-3’，扩增产物长度为312 dp。GATA-3的上游引物为5’-AGGCAGGGAGTGTGTGAACT-3’，下游引物为5’-TTTTTCGGTTTCTGGTVTGG-3’，扩增产物长度为326 bp。β-actin上游引物为5’-GTGGGCCGCCGACACCA-3’，下游引物为5’-CGGTTGGCCTTGGGATTGAG-3’，扩增产物长度为247 bp。反应体系选择为25 μL，在94 ℃预变性处理2 min，30 s 94 ℃、50 s 60 ℃、1 min 72 ℃循环，持续25个循环，在73 ℃中延伸处理3 min。在浓度为1.2%的琼脂糖凝胶中加入10 μL的扩增产物，在100 V的电泳环境下处理20 min,采用图像分析软件分析各条带的平均灰度值，以扩增的β-actin为内参照，计算各指标的相对表达量。②生活质量：分别于治疗前及治疗第3，5，7天以改良Barthel指数(MBI)评分[5]评价2组患者生活质量。③统计2组治疗过程中不良反应发生情况。

1.4统计学方法 采用SPSS 15.0软件包进行数据处理。计数资料比较采用2检验；计量资料采用表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组治疗前后血清T-betmRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3表达情况比较 2组治疗前T-betmRNA、GATA-3 mRNA与T-bet/GATA-3表达情况比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。治疗1个疗程后，2组T-betmRNA、T-bet/GATA-3表达水平均明显降低(P均<0.05)，GATA-3 mRNA表达水平均明显升高(P均<0.05)；观察组治疗后T-bet mRNA、T-bet/GATA-3表达水平均明显低于对照组(P均<0.05)，GATA-3 mRNA表达水平均明显高于对照组(P均<0.05)。见表1。

2.22组治疗前后MBI评分比较 2组治疗前MBI评分比较差异无统计学意义(P>0.05)，2组治疗3 d、7 d、14 d后MBI评分均明显高于治疗前(P均<0.05)，且观察组明显高于对照组(P均<0.05)。见表2。

表1 2组治疗前后PBMC中T-bet mRNA、GATA-3 mRNA与T-bet/GATA-3表达情况比较

表2 2组治疗前后MBI评分比较分)

注：①与治疗前比较，P<0.05。

2.32组治疗过程中不良反应发生情况比较 对照组患者治疗中出现头痛2例，心悸1例，不良反应发生率为7.5%；观察组患者治疗中出现头痛1例，皮肤过敏1例，不良反应发生率为5.0%。2组不良反应发生率比较差异无统计学意义(2=0.709,P>0.05)。

3 讨 论

急性脑梗死属于中医 “中风”范畴，早在《黄帝内经》中就有相似疾病名称的论述。主要的致病机制是血气逆乱，瘀血阻滞，所以血瘀证是急性脑梗死的主要中医证型。醒脑静注射液是在安宫牛黄丸的基础上改进的水溶性中药注射制剂，主要成分为栀子、麝香、冰片、郁金等。其中麝香气味芬芳，具有良好的通痹开窍功效，是回苏醒神的主要药物[6]。而冰片性微寒而味辛苦，能够疏散郁火而通诸窍，与麝香配合能够有效开窍醒神[7]。栀子则能够通泻三焦之火，具有解毒利湿、凉血清热的功效[8]。郁金能够止痛祛瘀活血、解郁凉血、行气清心[9]。多种药物联合作用，可以有效发挥活血祛痰、开窍醒神、解毒清热的功效。本研究中，观察组应用醒脑静注射液治疗2周后，患者的生存质量MBI评分明显高于治疗前及同期对照组，表明联合醒脑静注射液治疗相比单纯西药治疗可以有效改善患者生存质量，对疾病康复有积极作用。

急性脑梗死患者发病后的炎性症状以及免疫系统反应导致的机体炎性因子水平升高，是脑梗死区域以及缺血性半暗带区域的神经元损伤主要原因[10]。而其中T细胞免疫功能紊乱是急性脑梗死发病中的重要因素[11]，Th1与Th2细胞因子的平衡失调与急性脑梗死的发病以及进展有着密切关系[12]。Th1与Th2细胞亚群都是通过Th0前体细胞分化产生的，T-bet与GATA-3是Th1与Th2细胞分化的主要调节因子，在Th1与Th2细胞中表达呈现出特异性，二者是细胞分化过程中具有相反方向调控作用的因子[13-14]。T-bet与GATA-3能够决定Th前体细胞是分化成为Th1或者是Th2细胞，所以说转录因子T-bet与GATA-3是确定Th0细胞分化方向的具体指标，而T-bet/GATA-3比值能够反映Th1/Th2的分化情况，相比单一的因子表达更加客观，能够确定Th1与Th2的免疫平衡状态。T-bet与GATA-3还可以与不同炎症因子相结合，构成相互调节的环状通路，实现动态调节的功能。近年来的研究中发现，通过有效的干预方法可以调节T-bet/GATA-3的信号传导通路，进而改变二者的活性水平，完成Th1与Th2平衡的调节[15]。本研究中，治疗后观察组PMBC中T-bet mRNA表达水平明显降低，而GATA-3 mRNA表达水平明显升高，T-bet/GATA-3比值明显降低。表明醒脑静注射液可以在细胞分化的最初过程发挥作用，可以有效抑制Th1的免疫反应，调节Th1/Th2失衡的免疫反应逐渐向Th2倾斜，缓解免疫系统功能失衡状态。

综上所述，醒脑静注射液辅助治疗血瘀证急性脑梗死，可发挥T-bet/GATA-3的双向调节作用，从而恢复Th1与Th2细胞亚群的免疫平衡，改善患者生存质量，安全性也较好。但是醒脑静注射液对患者T-bet/GATA-3平衡调节的具体机制还没有完全明确，需要更多的研究支持。