LOX-1对ox-LDL诱导的小鼠巨噬细胞MMP-9表达的影响

刘佳佳,边云飞,肖传实,张娜娜,杨志明,杨慧宇

(山西医科大学第二临床医学院心内科,太原 030001;*通讯作者,E-mail:yanghuiyu2010@126.com)

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一类主要在巨噬细胞合成与动脉粥样硬化斑块不稳定及破裂关联非常密切的蛋白水解酶类。斑块局部巨噬细胞合成的MMPs通过降解纤维帽成分从而破坏其结构促使斑块破裂[1]。在巨噬细胞上有很多种LDL的受体以及相对应的配体。LOX-1是近年来首先在牛血管内皮细胞上发现的属SR型的ox-LDL受体,属于C型凝集素家族的Ⅱ型膜表面糖蛋白,这点不同于其他SR。进一步的研究发现巨噬细胞和血管平滑肌细胞(VSMCs)膜上亦有与内皮细胞基因序列完全相同的LOX-1表达,并可识别和结合ox-LDL,在动脉粥样硬化的早期阶段促进泡沫细胞的形成[2,3]。以往实验结果显示,MMP-9在进展期斑块中的分布同氧化低密度脂蛋白受体LOX-1具有区域一致性,并且在表达量上两者呈现相关性,表明LOX-1与MMP-9之间存在着重要关系[4],而LOX-1是近年来发现的ox-LDL的受体,因此猜测ox-LDL是通过LOX-1诱导巨噬细胞MMP-9 mRNA及蛋白表达水平上调,本实验通过构建LOX-1小干扰RNA(LOX-1-siRNA)抑制LOX-1基因表达后,观察LOX-1对ox-LDL诱导巨噬细胞MMP-9表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

小鼠单核巨噬细胞(细胞代号RAW264.7,ATCC,USA),LOX-1单克隆抗体(Santa Cruz,美国);MMP-9单克隆抗体、ox-LDL购自中国医学科学院基础医学研究所;蛋白抽提试剂盒(Cell signaling,美国),RT-PCR试剂盒、逆转录试剂盒(RevertAidTMFirst strand Cdna Synthesis Kit,Fermentas)、引物(大连宝生物有限公司)。

1.2 shRNA的设计及LOX-1-siRNA的构建

根据GenBank提供的Lox-1基因序列(OLR1为NM-138648),通过Blast挑选2个长为19个碱基的特异性寡核苷酸序列,序列1(LOX-1-siRNA1)为5′-GTCAGTGACCCTTATTGTA-3′,序列2(LOX-1-siRNA2)为5′-GTGGCCA GTTACTA CAAAT-3′。构建LOX-1基因发卡样siRNA(short hairpin small interference RNA,shRNA)真核表达载体(由武汉晶赛生物工程技术有限公司完成)。

1.3 细胞培养及转染

培养RAW264.7细胞,培养基为含10%胎牛血清的DMEM(GIBCO-BRL公司),5% CO2、37 ℃的培养箱,稳定传代后以1×106/孔接种于6孔板,60%细胞汇合时进行转染,将RAW264.7细胞分为4组,分别为空白对照组、LOX-1-siRNA1组、LOX-1-siRNA2组和质粒对照组。采用LipofectamineTM2000(Invitrogen Corporation)转染试剂,参照试剂说明书,每孔LOX-1-siRNA的转染量为2 μg,每组设3个复孔。转染48 h使用Olympus荧光显微镜,先后在自然光和紫外激发光源经GFP特异性滤色片滤光后观察各组细胞转染情况,选出最佳转染组。

1.4 实验分组

随机将RAW264.7细胞分成4组:对照组,即RAW264.7细胞正常培养组;ox-LDL组,即200 μg/ml ox-LDL与细胞共同孵育24 h;ox-LDL+LOX-1-siRNA组,即LOX-1-siRNA量为1.0 μg、Lipofectamine2000的量为2 μl转染RAW264.7细胞48 h,再加入200 μg/ml ox-LDL共同孵育24 h;pGenesil组,即空质粒组。

1.5 荧光定量PCR检测LOX-1及MMP-9 mRNA水平

LOX-1及MMP-9 mRNA的表达情况采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time RT-PCR)检测,使用Trizol提取总RNA,并按照试剂盒说明(TaKaRa)将其逆转录成cDNA。以cDNA为模板,按两步法扩增:95 ℃预变性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,共40个循环。实验重复3次,取平均值。

1.6 Western blot检测LOX-1及MMP-9蛋白表达水平

用细胞裂解液将巨噬细胞裂解,提取上清液即为总蛋白量,测定蛋白浓度。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法将30 μl的总蛋白质样品分离,转膜,经脱脂奶粉封闭2 h,加入羊抗鼠LOX-1及MMP-9单克隆抗体(1 ∶1 000)于4 ℃冰箱过夜,洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶1 000)共同孵育1 h,化学发光试剂显色,分析蛋白条带的吸光度。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 观察细胞形态

使用含10%无酚红的DMEM培养基(高糖型)培养RAW264.7细胞,细胞生长良好。传代后多数细胞于2 h贴壁,主要为类圆形和不规则形,体积小,生长快,一般含1-2个核,5-6 d可汇合,有伪足。

2.2 转染后各组细胞LOX-1 mRNA的表达变化

与空白对照组和质粒对照组相比,转染LOX-1-siRNA1及LOX-1-siRNA2 48 h后两组LOX-1 mRNA的表达均明显下调(分别为0.673±0.087和0.482±0.110),差异有统计学意义(P<0.05),而且LOX-1-siRNA2的抑制作用更强一些(P<0.05),而空白对照组与质粒对照组转染后LOX-1 mRNA表达差异无统计学意义(1.00±0.01vs1.00±0.05,P>0.05)。

2.3 转染后各组LOX-1蛋白表达情况

Western blot结果显示:与空白对照组和质粒对照组相比,转染LOX-1-siRNA1及LOX-1-siRNA2 48 h后细胞LOX-1蛋白表达明显降低(0.576±0.105和0.432±0.074),差异有统计学意义(P<0.05),而且LOX-1-siRNA2的抑制作用更强一些(P<0.05),而空白对照组与质粒对照组转染后LOX-1的蛋白表达差异无统计学意义(0.83±0.089和0.84±0.144,P>0.05),与RT-PCR结果一致(见图1)。

2.4 荧光显微镜观察不同转染条件下的转染结果

用不同比例的质粒LOX-1-siRNA2与脂质体转染剂的复合物转染小鼠单核巨噬细胞后48 h,在荧光显微镜下可以观察到转染组绿色荧光细胞数量达到80%以上,而对照组无明显荧光表达。当LOX-1-siRNA2量为1.0 μg，脂质体转染剂为2 μl时转染效率最高，与其他任何组合相比，均差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

LOX-1蛋白的表达量用LOX-1条带的灰度值/内参照actin的灰度值表示;与空白对照组和质粒对照组比较,#P<0.05;与LOX-1-siRNA1相比,*P<0.05

表1 荧光显微镜观察不同转染条件下的转染效率Table 1 Transfection efficiency in different transfection conditions under fluorescence microscope

2.5 LOX-1-siRNA对ox-LDL诱导巨噬细胞MMP-9 mRNA表达的影响

RT-PCR结果分析显示:与对照组相比,ox-LDL(200 μg/ml)诱导RAW264.7细胞24 h后,MMP-9 mRNA表达水平明显上调(0.788±0.024vs1.017±0.252,P<0.05)。pGenesil组(0.760±0.099)与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。ox-LDL+LOX-1-siRNA组与ox-LDL组比较差异有统计学意义(0.938±0.098vs1.017±0.252,P<0.05)。

2.6 LOX-1-siRNA对ox-LDL诱导巨噬细胞MMP-9蛋白表达的影响

Western blot结果表明,ox-LDL诱导RAW264.7细胞24 h后,MMP-9蛋白表达明显增加,与对照组比较有统计学差异(3.494±0.315vs0.986±0.057,P<0.05)。ox-LDL+LOX-1-siRNA组蛋白表达与ox-LDL组比较差异有统计学意义(2.822±0.216vs3.494±0.315,P<0.05)。pGenesil组MMP-9蛋白与对照组比较无统计学意义(P>0.05,见图2)。

图2 LOX-1-siRNA对ox-LDL诱导巨噬细胞MMP-9蛋白表达的影响Figure 2 Effect of LOX-1-siRNA on ox-LDL-induced MMP-9 protein expression in macrophages

3 讨论

动脉粥样硬化严重威胁着人类的健康,在动脉粥样病变早期,单核细胞/巨噬细胞摄入化学修饰低密度脂蛋白尤其是氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),形成巨噬源性泡沫细胞被认为是动脉粥样病变的关键环节。基质金属蛋白酶(MMP)是细胞外基质代谢的关键酶,通过降解Ⅳ型胶原(血管基底膜的主要结构成分)与动脉粥样硬化斑块的形成和破裂密切相关。研究表明,在人类动脉粥样硬化斑块肩部及巨噬泡沫细胞聚集区MMP-9的表达增高,MMP9是MMP家族的成员,能够降解细胞外基质(ECM)成分和血管壁的基底膜。这会导致纤维帽破裂,影响斑块稳定性。MMP9的表达增加与许多疾病相关,同时可促进动脉粥样硬化的发展,并被认为是导致斑块不稳定的主要因素[5,6]。研究证实,培养的人巨噬细胞经过ox-LDL的诱导,MMP-9,MMP-3,MMP-1表达显著增加,而巨噬细胞是产生MMP-9的主要来源[3]。本实验通过ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞24 h后,分别使用反转录-多聚酶反应(RT-PCR)和Western blotting的方法检测各组MMP-9的mRNA和蛋白表达水平证实了上述观点。

血管壁细胞上有多种受体可供ox-LDL结合,LOX-1是近年来首先在牛血管内皮细胞上发现的ox-LDL受体。研究发现,在血管平滑肌细胞内ox-LDL促进LOX-1及MMP-9的mRNA表达呈计量依赖性,当用LOX-1特异性抗体PIA预刺激后,ox-LDL对MMP-9 mRNA的诱导作用明显被抑制。本研究旨在探讨LOX-1对ox-LDL介导的小鼠巨噬细胞MMP-9表达的影响,研究发现,在ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞24 h后,可以促进巨噬细胞MMP9的表达,通过构建LOX-1小干扰RNA(LOX-1-siRNA)抑制LOX-1基因表达后,进一步观察到ox-LDL对巨噬细胞MMP9蛋白及 mRNA的诱导作用明显被抑制了,提示ox-LDL诱导巨噬细胞MMP-9表达这一过程中,LOX-1起到了关键的介导作用。LOX-1对ox-LDL诱导的小鼠巨噬细胞MMP-9表达的影响可能是动脉粥样硬化形成和不稳定斑块形成的机制之一,也可能是血管事件发生的原因之一。近年来,巨噬细胞通过介导氧化应激参与心血管疾病的发生发展已成为研究热点。研究发现,ox-LDL与LOX-1的结合还可通过线粒体电子传递链、NADPH氧化酶等途径诱导内皮细胞活性氧的产生,由此可以猜测LOX-1对ox-LDL介导的小鼠巨噬细胞MMP-9表达的机制可能是通过线粒体电子传递链或NADPH氧化酶等途径实现。