血府逐瘀汤对缺血性脑卒中大鼠保护作用的代谢组学研究

徐 敉,许春立

(1上海市沪东医院内科,上海 200129;2上海中医药大学附属第七人民医院神经内科;*通讯作者,E-mail:2059015451@qq.com)

脑卒中是全世界范围内的普遍高发的一类脑血管疾病,是造成人类死亡的主要疾病之一,发病年龄有年轻化的趋势。脑卒中的病因复杂,治疗困难,发病突然,是其主要的危害性所在[1]。血府逐瘀汤是以中药成分治疗脑卒中、颈动脉硬化等疾病的常用复方药[2],其治疗脑卒中的作用机制尚未完全阐明。代谢组学在疾病病理机制与中药复方及其疗效机制研究中得到了广泛的应用[3]。目前,利用代谢组学技术研究血府逐瘀汤液对缺血性脑卒中保护作用的研究未见报道,本研究构建大鼠脑缺血模型,通过代谢组学技术探究血府逐瘀汤对脑缺血大鼠的神经保护作用的潜在的代谢干预机制,为血府逐瘀汤的临床应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

色谱级甲醇和乙腈购于Oceanpak公司(瑞典)。色谱柱:UPLC HSS C18色谱柱(型号:100×21×17)购于美国Waters公司。Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪G2-X2 QTOF四极杆飞行时间串联质谱仪购于美国Waters公司。

1.2 动物实验与分组

30只雄性SD大鼠(8周龄,体质量180-220 g,清洁级)及饲养饲料购于上海斯莱克实验动物有限公司,动物生产许可证号:SCXK(沪)2017-0005。购回后常规饲养,室温22-24 ℃。10只大鼠随机分为假手术组、模型组和中药治疗组,每组10只,给予饲料和饮水,适应性饲养7 d开始给药和造模,给药时间点为造模前48 h,24 h,2 h和造模后24 h,48 h和72 h。血府逐瘀汤由当归9 g,生地黄9 g,红花9 g,赤芍6 g,柴胡3 g,枳壳6 g,桔梗4.5 g,桃仁12 g,牛膝9 g,川芎4.5 g,甘草6 g组成。经水煎后过滤浓缩成浓度为2 g/L,中药治疗组灌胃血府逐瘀汤剂量为10 g/kg。假手术组和模型组在相同时间点灌胃等剂量的生理盐水。造模后24 h进行神经功能评分,造模48 h,所有大鼠均摘眼球取血,制备血清,用于质谱检测血清代谢谱。

1.3 大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的建立

MCAO模型是常用的缺血性脑卒中动物模型。造模方法参考文献[4],具体操作步骤如下:10%水合氯醛麻醉,随后颈部备皮,消毒铺巾,颈部正中切一开口,暴露颈总动脉、颈内外动脉,距离颈总动脉分叉4 mm处结扎颈外动脉远心端,在颈外动脉穿入另一根6-0丝线,在靠近颈总动脉分叉处打活结,动脉夹夹闭颈总动脉,并在距离颈总动脉分叉处3 mm处的颈外动脉上剪开一小口,将一根头端处理过的0.33 mm直径的尼龙线从小口中插入,进入颈内动脉,并向内插入大脑中动脉,尼龙线的插入深度距离颈总动脉分叉处约16 mm,缺血后90 min拔掉线栓,缝合颈部伤口。假手术组不插入线栓,其他操作同模型组。造模后24 h对各组大鼠进行神经功能评分。

1.4 神经功能评分

神经功能评分参考Longa及Bederson的5分法:0分,无神经损伤症状;1分,对侧前爪不能完全伸展;2分,向对侧转圈;3分,向对侧倾倒;4分,不能自发行走,意识丧失。分值越高,说明动物神经行为障碍越严重[5]。

1.5 代谢组学检测代谢产物

血液代谢物提取:准确称取200 μl血液样品,加入甲醇400 μl,旋涡30 s混匀,12 000 r/min,4 ℃离心10 min。取上清液,用氮气吹干,加入200 ml甲醇水(w/w为1 ∶1)超声溶解,0.22 μm滤膜过滤,待上样;进样量:2 μl;色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C8(10 cm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:A相为0.1%甲酸,B相为乙腈;梯度洗脱0-30 min,10%-90% B液,流速300 μl/min;质谱条件:离子源电压4.5 kV,毛细管电压49 V,毛细管温度325 ℃,采集正离子模式数据,扫描范围100-800 m/z。

1.6 质谱数据分析

原始数据导入XCMS软件进行保留时间校正、峰积分等,和数据库进行匹配和校正(参数:FWHM=10,BW=10,snthersh=5,其他默认值)。80%以上样品所含峰为共有峰进行数据过滤。定性后的数据分析采用SMICA 14.1、Kegg和MetaboAnalyst等软件或在线数据库进行分析。首先,采用峰面积法对所有峰进行面积归一化(单个峰面积/总面积),将整理好的数据导入SMICA软件中进行单变量分析和多变量分析,分析方法参考文献[6],单变量分析采用Student’sttest,多元变量统计分析采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA),分别绘制两种模型二维的主成分得分平面图,对于OPLS-DA分析进行置换检验,检验模型是否存在过拟合,并计算差异贡献变量指标VIP值。进一步筛选同时满足单变量分析中P<0.05和OPLS-DA分析中VIP>0.05的化合物作为代谢标志物。将筛选到的代谢物整理并导入MetaboAnalyst网站进行代谢通路拓扑分析和富集分析。

2 结果

2.1 血府逐瘀汤液对CIS大鼠保护作用及代谢标志物

血府逐瘀汤液干预CIS大鼠后神经功能损伤情况有显著缓解,模型组神经功能评分显著高于假手术组和给药组(见图1)。通过所有样本在PCA模型的主成分得分散点图可以看出,三组样本之间均有较为明显的区分,其中给药组与假手术组的分布更为接近,且与模型组有明显的区分(见图2A),揭示血府逐瘀汤液对CIS大鼠症状可能有改善作用。通过OPLS-DA分析得到每两组之间的预测主成分(t[1])和正交主成分(to[1])的得分散点图(见图2B-D),三个模型对给药组和假手术组、给药组和模型组、模型组和假手术组之间的差异有显著的区分能力,且三个模型的R2Y和Q2分别为0.998和0.525,0.986和0.612,0.991和0.627。结合置换检验得到的结果均证明模型具有较好的预测能力,没有出现过拟合的情况。确认模型可靠后,通过软件计算得出,每个OPLS-DA模型中所有代谢物(变量)对组间区分的变量投影重要度(VIP)值,根据VIP大于1和T检验得到的P<0.05筛选代谢标志物,代谢标志物信息见表1。从表1中可以看出,模型组和假手术组之间筛选出16个差异代谢物,其中显著上调的代谢物有12个,下调的有4个,给药组与模型组相比,筛选出14个差异代谢物,其中显著上调的有4个代谢物,下调的有10个代谢物。模型组上调的12个代谢物中,给药组有7下调,模型组下调的4个代谢物中,给药组有3个下调。说明血府逐瘀汤液对CIS大鼠的保护作用与多个代谢物参与的代谢途径有关。

与假手术组相比,**P<0.01

表1 血府逐瘀汤液对CIS大鼠保护作用的潜在内源性代谢标志物Table 1 Metabolites in protective effect of Xuefu Zhuyu decoction against CIS in rats

2.2 血府逐瘀汤液对CIS大鼠保护作用的代谢通路分析

进一步对筛选到的给药组与模型组之间的差异代谢物,导入MetaboAnalyst 4.0 进行代谢通路拓扑分析和富集分析,结果见图3,图中纵坐标表示富集分析的P值,横坐标表示拓扑分析的Impact值。由图3可以看出,血府逐瘀汤对CIS保护作用的代谢途径主要有氨基酸代谢(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和色氨酸代谢)、鞘磷脂代谢和丁酸代谢等。以上代谢途径可能是血府逐瘀汤对CIS大鼠脑神经保护作用的代谢机制。

3 讨论

脑血管疾病是一类由血管病变、血液成分变化和血液动力学改变引起的出血性或缺血性脑病。脑缺血发病机制复杂,并通过多种代谢途径产生脑神经损伤,包括能量代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、神经递质等多种代谢途径紊乱[7,8]。传统中药对脑缺血有较好的治疗和神经保护作用,常用于脑卒中患者的治疗。近年来,基于质谱技术的大量代谢组学研究表明,多种传统中药复方对缺血性脑卒中的保护和治疗作用与多种代谢途径的调节有关,如氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢等[9-12]。血府逐瘀汤为最早源自清代的活血化淤的经典方,常用于淤血病证的治疗,对脑卒中也有较为显著的疗效。现代医学证明,淤血是缺血性脑卒中的最常见发病机制,淤血阻滞,造成血流动力学改变,脑髓失养,重者造成半身不遂、言蹇舌强和麻木不仁等症状。因此对缺血性脑卒中的治疗,可以采用活血化瘀法,促进血液流动,进而减轻脑缺血产生的神经损伤。现代药理学研究表明,血府逐瘀汤具有扩张血管、促进血液流动、抗血栓、抗动脉硬化等作用。此方中桃仁、红花、川芎、当归、生地黄、当归和赤芍乃为活血祛淤良药,柴胡、枳壳则理气,牛膝有引血下行、活血通经之功效,桔梗载药上行,诸药配伍,可达到活血化淤和理气通络之功效[13,14]。本研究结果显示血府逐瘀汤对CIS治疗作用的代谢途径主要有氨基酸代谢(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和色氨酸代谢)、鞘磷脂代谢和丁酸代谢等。

本研究通过线栓法构建缺血性脑卒中大鼠模型,通过代谢组学技术检测代谢物在血府逐瘀汤对缺血性脑卒中大鼠治疗作用的变化。结果在模型组和假手术组之间筛选出16个差异代谢物,其中12个显著上调,4个显著下调;治疗组与模型组对比,筛选出14个差异代谢物,其中4个显著上调,10个显著下调。模型组上调的12个代谢物中,在给药组中有7下调,模型组下调的4个代谢物中,治疗组有3个下调。从代谢水平揭示血府逐瘀汤对缺血性脑卒中具有治疗作用,能部分逆转或保护脑缺血产生的神经损伤。通过进一步的代谢通路分析发现,血府逐瘀汤对大鼠的多种氨基酸代谢、鞘磷脂代谢和丁酸代谢有调控作用[15]。研究表明,大鼠脑缺血后谷氨酸-谷氨酰胺代谢、天冬氨酸-肌酸代谢等氨基酸代谢紊乱,说明脑缺血导致了脑组织神经元细胞的损伤[16],本研究的结果表明谷氨酸和天冬氨酸代谢的异常,同时还提示精氨酸和脯氨酸代谢异常,甘氨酸、丝氨酸和色氨酸代谢紊乱。鞘磷脂代谢参与多种生理过程,如细胞分化、增殖、分化、神经调节、炎症信号等。研究发现,脑缺血患者二氢神经鞘氨醇和植物鞘氨醇上调引起鞘磷脂代谢异常,可能诱导细胞坏死、凋亡和炎症,从而引发脑卒中[17]。丁酸是体内存在的一种与多种生理病理过程有关的小分子短链脂肪酸[18],本研究发现,CIS大鼠丁酸代谢异常,可能与γ-氨基丁酸(GABA)神经调节功能有关。

综上所述,血府逐瘀汤对缺血性脑卒中大鼠有显著治疗作用,并可能与调节氨基酸代谢、鞘脂类代谢和丁酸代谢有关。