屠豪炎,雷小灿,霍 鹏,乐江华,张 顺
1桂林医学院附属医院生殖医学中心,广西桂林 5410012遵义医学院基础医学院,贵州遵义 563100 桂林医学院 3公共卫生学院 4附属医院产科,广西桂林 541001
卵泡发生起始于原始卵泡的募集,以卵泡排卵或者卵泡闭锁而终止。卵泡发育从形态学上分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡和成熟卵泡,从动态学上分为原始卵泡的发育和启动募集、初级和次级卵泡的发育、优势化卵泡的选择、卵泡闭锁、排卵和黄体生成[1]。女性1个典型的生理周期中约有1000个卵泡开始生长,但是仅有1~2个卵泡最终完成排卵,1名女性的整个生命周期中大约有450~500个卵泡发生排卵,而在初情期开始到绝经期大约有250 000个卵泡发生闭锁。
卵泡发育与女性生育力密切相关,据相关统计表明,我国不孕症发生率为10%~15%,并且呈逐年上升趋势[2],其中卵泡发育不良和排卵障碍占该病发生的20%~40%[3],然而因卵泡发育不良所造成不孕症占不孕症患者总数的27%,重复率高达63.8%[4]。文献报道颗粒细胞能量代谢的异常是造成女性卵泡发生异常、生育力下降的重要原因[5-6],因此明确其调控机制,找到疗效确切、方便可行的治疗靶点成为学者们共同关注的热点问题。本文将着重从卵泡发生过程中的能量代谢需求及调控机制的研究现状进行综述。
正常卵泡发生过程中的能量需求主要依靠颗粒细胞通过其细胞膜上葡萄糖转运蛋白(glucose transporter,GLUT)摄取周围组织中的葡萄糖,经糖酵解途径生成丙酮酸和乳酸作为主要能量来源。随着卵泡直径和卵泡液的增加,卵泡液中的乳酸含量亦逐渐增加,而葡萄糖的含量与卵泡直径呈负相关,卵泡直径越大葡萄糖浓度越低[7],同样乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)的活性和水平亦有此趋势[8]。Boland等[9]发现发育中的卵泡具有很高的糖酵解活性,当用高浓度的葡萄糖、丙酮酸和乳酸联合培养颗粒细胞时,其增殖能力显著提高[10]。山羊卵母细胞中糖酵解速率是氧化磷酸化的1.5倍,而卵丘卵母细胞复合体中糖酵解速率是氧化磷酸化的3倍之多[11],特别在低氧状态下,卵泡中糖酵解相关基因GLUT1、GLUT3、己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)和LDH的表达显著上调[12-13]。研究提示,卵母细胞不能直接利用糖酵解进行供能,从原始卵泡开始,颗粒细胞就表现出较强的糖酵解活性[14],颗粒细胞中磷酸果糖激酶(phosphofructokinse,PFK)及LDH的表达显著高于卵母细胞,在窦卵泡中表达最强,其糖酵解产生的终产物丙酮酸和乳酸可作为卵母细胞的主要能量来源[15]。研究发现,在体外培养的卵母细胞培养基中加入丙酮酸和乳酸,可通过改善细胞内部的氧化还原状态和能量供应显著抑制卵母细胞老化的进程[16]。因此,阐明卵泡颗粒细胞糖酵解途径生成的丙酮酸和乳酸的调控过程对卵泡发育和卵母细胞生长起着重要作用。
多囊卵巢综合征对卵泡发生能量代谢的影响多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是女性常见的生殖内分泌代谢性疾病,主要临床表现为无排卵或稀发排卵造成的月经紊乱、高雄激素血症、肥胖、卵巢呈多囊样改变,从而导致不孕[17]。Harris等[18]发现PCOS患者卵泡的生长同正常组相比需要更多的丙酮酸来维持,同时,磁共振检测PCOS患者卵泡液中的代谢产物发现,乳酸、丙酮酸的含量较正常女性显著减少[6]。本课题组尚未发表的前期研究显示,PCOS大鼠卵巢中GLUT1的表达显著升高、HK的表达显著降低,提示PCOS大鼠对葡萄糖的利用能力下降;同时单羧酸转运蛋白(monocarboxylate transporter2/4,MCT2/4)和LDH、PFK、PKM等限速酶基因的表达下调,暗示了卵巢中丙酮酸和乳酸浓度的显著下降,其基因表达结果同文献报道的葡萄糖聚集、丙酮酸和乳酸生成减少的表现相一致[19]。Lin等[20]对正常及PCOS患者卵泡液研究发现,胰岛素可以促进正常组卵巢颗粒细胞乳酸形成,而PCOS中则无明显改变,且体外实验结果也表明,高水平睾酮(T)抑制小鼠卵巢颗粒细胞的乳酸生成[21]。以上研究均表明,PCOS患者卵泡生长一方面需要更多的丙酮酸和乳酸刺激才能正常发育,另一方面高雄激素和胰岛素抵抗又降低乳酸的含量,两方面共同作用表现为维持正常卵泡发育的代谢物质供给远远小于需求。
早发性卵巢功能不全早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指女性在40岁以前出现卵巢功能减退,主要表现为月经异常(闭经、月经稀发或频发)、促性腺激素水平升高[促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)>25 U/L]、雌激素水平波动性下降。而卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指女性40岁以前出现闭经、促性腺激素水平升高(FSH>40 U/L)和雌激素水平降低,并伴有不同程度的围绝经期症状,是POI的终末阶段[22]。卵巢颗粒细胞和卵母细胞中线粒体的含量丰富,能够调节颗粒细胞及卵母细胞的ATP水平,为其发育提供能量。研究发现,POF患者线粒体DNA(mitochondrial deoxyribonucleic acid,mtDNA)含量比正常人低,且mtRNA突变可以影响细胞内氧化磷酸化水平,降低电子呼吸链的传递,从而影响颗粒细胞凋亡及卵泡发育[23]。卵泡的闭锁与颗粒细胞的凋亡密切相关,线粒体膜通透性增加及活性氧的增多均会导致颗粒细胞凋亡,当大量卵泡发生闭锁就会引发POF。近年研究发现,线粒体融合蛋白在线粒体中有着重要作用,而Mfn2在卵母细胞成熟中起着重要的调控作用。应用大鼠POF模型的研究发现,Mfn2与POF有一定的相关性,通过降低线粒体膜电位,影响线粒体供能,减少ATP形成,导致卵泡发育障碍可产生POF[24]。但关于卵泡发生过程中能量代谢紊乱与POI的发病机制和治疗方案的研究还鲜见报道。
内分泌因素卵泡发育是一个复杂的过程,主要受下丘脑—垂体—性腺轴分泌的生殖激素调控,垂体分泌FSH和促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)作用于卵巢,FSH在促进卵泡生长、成熟,对颗粒细胞增殖、内膜细胞分化、卵泡液的分泌均具有促进作用;LH可选择性诱导排卵前的卵泡生长发育,并触发排卵;刺激颗粒细胞合成雌二醇[25]。研究显示,FSH在LH协同作用下可调控卵泡能量代谢,促进卵泡成熟、排卵。Alvarez等[26]在体外培养猪丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexs,COCs)中发现,在促性腺激素(FSH、LH)作用下,卵丘细胞对葡萄糖的摄取量增加;同样在体外培养人卵泡颗粒细胞中添加FSH可增加乳酸的生成,提高卵丘细胞的糖酵解速率[26-27]。FSH可以增加大鼠卵巢颗粒细胞GLUT1/GLUT4的表达,从而增加葡萄糖的摄取[28],且FSH可以通过促进HK、PFK活性上调,促进乳酸生成,增加腔前卵泡和刺激卵巢中COCs的糖酵解速率[29-30]。FSH和LH在卵泡的发育过程中侧重于调控不同的糖酵解限速酶,在小的腔前卵泡(<90 μm)中,LH可上调PFK活性;而在较大腔前卵泡(90~250 μm)中,FSH主要通过刺激PKM的活性增加卵泡乳酸生成[30]。LH通过结合卵泡膜细胞(theca cell,TC)上的LH受体,使TC产生雄激素[31],当发生PCOS时,机体内含有过多的雄激素,阻止优势卵泡发育,导致卵泡闭锁及卵子退化[32]。因此,通过结合生殖内分泌和卵泡代谢物含量的检测,对临床上判断PCOS卵泡发育异常有一定的指导意义。
信号转导通路的调控近年研究发现,磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)和肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)/AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路相关因子共同参与调控卵泡颗粒细胞增殖、卵泡直径变化、成熟和周期性排卵等过程。报道显示活化的PI3K可以促进颗粒细胞的增殖和分化,促进卵母细胞的生长及排卵等多个过程,其失活可导致原始卵泡直接从静止状态死亡,但过度激活可使原始卵泡过早发育及卵泡过快凋亡[21]。
PI3K/AKT是胰岛素调节糖代谢方向传递的关键通路,活化的PI3K通过抑制烯醇式丙酮酸羧激酶(pyruvate carboxykinase,PEPCK)而阻断糖异生,同时上调GLUT的表达,增加葡萄糖利用;并通过增强PFK的活性来调控糖酵解的进程[33]。癌症相关研究显示,抑制PI3K/AKT通路后可显著降低食管癌细胞的糖酵解速率,同时GLUT和HK蛋白的表达也著降低[34]。Jiang等[35]发现LKB1/AMPK信号通路也参与了卵泡的发生,LKB1的缺失可以降低AMPK活性,导致原始卵泡池过早激活,甚至造成POF。相关研究表明,AMPK(AMP依赖性蛋白激酶)为葡萄糖感受器,LKB1是其上游激酶,多年以来人们认为AMP/ATP比值为AMPK激活的调控核心,而林圣彩等[36]发现,LKB1可通过调节糖酵解关键酶—醛缩酶的机制激活AMPK。有学者发现,当AMPK激活后心肌的葡萄糖摄取量增加,激活PFK,增加糖酵解通量,同时减少PEPCK和葡萄糖- 6-磷酸酶(glucose- 6-phosphatase,G6P)的表达来抑制糖异生[37- 38]。本课题组尚未发表的前期研究显示,PCOS大鼠卵巢中的AKT和AMPK的表达水平显著降低,与卵巢中糖酵解相关限速酶的表达趋势一致,可以相信一定程度上激活PI3K/AKT及LKB1/AMPK信号通路可调控颗粒细胞糖酵解的活性并促进卵泡发育。但目前关于PI3K/AKT和LKB1/AMPK信号通路在调控卵泡发育中的能量代谢的机制还需进一步研究证实。
microRNA对卵泡发生能量代谢的调控microRNA(miRNA)是由长约22个核苷酸构成的内源性非编码的单链小RNA分子。在不同哺乳动物卵巢中,miRNAs都大量表达,并参与调控卵泡生长、闭锁、排卵和类固醇生成[39-40]。有研究发现,miR- 155可显著上调HK、GLUT、PFK、PKM2、LDH的表达;同时,过表达的miR- 155通过靶向激活细胞C/EBPβ(miRNA- 143转录激活剂)的表达,抑制miR- 143,增加细胞葡萄糖的消耗和乳酸的形成,促进细胞糖酵解代谢[41- 42]。不仅如此,许多miRNA也参与抑制糖酵解通路,研究发现miR- 93也与GLUT4相关,在机体中平衡胰岛素抵抗起着重要作用,尤其是在PCOS患者中,通过上调miR- 93的表达来调节胰岛素从而控制机体对葡萄糖的摄入[43]。miR- 143的过表达被证明在诸多癌症中,如:结直肠癌、宫颈癌、前列腺癌等中具有抑制生长作用,它通过抑制HK的表达来抑制葡萄糖的代谢[44],miR- 326表达增加可以降低PK的表达致使细胞凋亡[45],miR- 34a通过对LDH的抑制来下调糖酵解速率,减缓细胞的生长发育。尽管卵巢中miRNA的功能研究越来越多,但是关于卵巢中miRNA如何通过调控卵泡能量代谢参与卵泡发生,特别是卵泡液外泌体中miRNA作为鉴定卵泡发育异常指标的研究将成为卵泡发生领域研究的热点。
乙酰化修饰对卵泡发生能量代谢的影响组蛋白乙酰化修饰是表观转录调控的重要机制,主要通过组蛋白乙酰化酶(histone acetylase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)分别介导乙酰化和去乙酰化进程,几乎参与了细胞所有的正常活动,调控生命进程[46]。同时敲除HDAC1及HDAC2则会导致小鼠的生殖功能障碍,各级卵泡数量减少并且卵泡闭锁及卵母细胞凋亡数量增多[47- 48]。研究发现糖酵解的关键限速酶,如:PKM2、LDHA和PEPCK1受到乙酰化的调控[49]。PKM2在高糖状态下可发生乙酰化,导致细胞中乳酸集聚,促进肿瘤细胞的增殖和生长[50];LDH乙酰化后活性被抑制,肿瘤细胞增殖和转移受阻,而当LDH发生去乙酰修饰时,其活力增加,促进癌细胞生长和代谢[51]。Sirtuins家族(SIRT1- 7)属于高度保守并依赖NAD+的HDAC,研究发现SIRT1在卵巢中表达量显著高于其他组织,在卵巢颗粒细胞的表达中显著高于卵巢其他细胞[52]。SIRT1可使肝脏中糖异生相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子- 1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator- 1-alpha,PGC- 1A)去乙酰化,抑制葡萄糖输出,上调PKM及葡萄糖激酶糖酵解基因的表达[53]。SIRT2可使癌细胞中乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)发生去乙酰化,提升Warburg效应,增强癌细胞的增殖和分化[54]。SIRT6被报道可以通过去乙酰化修饰组蛋白H3K9来抑制糖酵解基因,抑制LDH的转录,将丙酮酸转移至线粒体三羧酸循环以产生高效ATP[55]。因此,阐明卵泡发生过程中能量代谢的乙酰化修饰机制对临床治疗因卵泡发育不良导致的女性不孕具有重要意义。
综上,能量代谢贯穿卵泡发生的全过程,在卵泡生长发育中发挥着重要作用。尽管本文已从传统的内分泌、信号传导通路以及近年来热门的miRNA、表观遗传4个方面初步阐述卵泡发生过程中能量调控机制,但各因素协作调控分子机制还有待深入研究。相信随着分子生物技术的不断发展与进步,探索卵泡发生过程中能量代谢及其调控机制,将成为当前生殖医学研究的热点。探讨能量代谢产物变化及其调控机制的关系,破解其在卵泡发生过程中的重要作用,可为全面阐述卵泡发生过程中能量代谢的分子机制奠定理论基础,并为临床上治疗女性不孕及女性生殖系统疾病提供新的指导。