Cockayne综合征患儿临床特征及基因突变研究一例报告

潘璐，刘艳秋

(江西省妇幼保健院产前诊断中心，南昌 330006)

科凯恩综合征（Cockayne syndrome，CS）是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，于1936年由英国儿科医生Cockayne[1]首次对该疾病进行报道。在美国及欧洲国家该病的发病率大约是2.7/1000000[2]，国内偶见散发个例报道。Coakayne综合征是一种以身材矮小、早衰外观为特征，该病特点包括体重不增、不能正常生长、头围异常小和神经系统发育受损。患儿对光极度敏感，少量阳光照射就能引起晒伤，其他症状包括听力丧失、眼部异常、蛀虫严重、骨质异常并有脑部特征性变化[3，4]。目前已知的主要致病基因有 ERCC6、ERCC8，ERCC8位于人类第5号染色体 （5q12.1），ERCC6位于人类第10 号染色体（10q11.13）[5]，另外少见的 XPB、XPD、XPG基因亦可导致Cockayne综合征[6]。本研究中，我们对1例Cockayne综合征患儿应用芯片捕获高通量测序及其父母采用Sanger测序法对ERCC6、ERCC8进行突变测序，明确其突变类型及突变形式，并根据遗传学规律指导该夫妇避免再次生育Cockayne综合征患儿。

1 对象与方法

1.1 对象 江西省妇幼保健院就诊患儿，男，5岁，足月分娩，分娩时无窒息、缺氧等，1岁内生长发育基本正常，2岁开始生长发育增长缓慢，并出现运动、智力发育迟缓，少量阳光照射即可出现晒伤、脱皮、色素沉着，3岁时能独立行走，步态不稳，并出现睾丸萎缩，眼球凹陷，间断出现腹泻，5岁时睾丸消失，现只会说简单的词句。该患儿为第二胎第二产，足月顺产，出生体重2.6kg，身长50cm，Apar评分9分，生后母乳喂养。专科检查：身高85cm，体重10kg，颜面部皮肤增厚、粗糙、脱屑，有色素沉着，眼球凹陷，头发稀疏，神志清楚，表情淡漠，心肺未闻及明显异常，肝脾稍偏大，睾丸消失。实验室检查：染色体 G 显带：46，XY；血常规、血凝、生化、自身免疫、血气分析、病原体及病毒检测等未见明显异常。头颅CT提示：颅内广泛性钙化。患儿父母非近亲婚配，无遗传家族病史。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 用含枸橼酸钠抗凝剂的真空采血管，分别采集患儿及其父母外周静脉血5ml，应用试剂盒 (采用美国OMIGA公司E.Z.N.A Blood DNA试剂盒)提取DNA，提取步骤参照试剂盒说明；取适量DNA用紫外分光光度进行定量和纯度检测，其余保存于-20℃备用。

1.2.2 基因芯片捕获高通量测序 应用基因芯片（华大基因有限公司）对靶基因进行捕获，对捕获的富集靶基因采用高通量测序(在Hiseq2000测序平台进行测序--美国 Illumina公司)对 ERCC6、ERCC8基因进行突变检测，采用Illumina配套软件进行信息处理和数据分析。

1.2.3 Sanger验证 利用Primer软件对目标位点进行特异引物设计（正向引物序列5，-GAGACTCCCA CTTCTCATACTCATAAAGGGGTGT-3’反向引物序列 5’ -GTCTTTGTCCTCTTTTTCGGCTTTTTC-3’）（引物由华大基因股份有限公司合成），对该患儿基因组DNA进行目标位点及上下游区域进行扩增；扩增产物采用天根通用DNA纯化试剂盒进行纯化；纯化产物用Beckman 8000型DNA测序仪进行测序；测序结果与基因库的ERCC6基因参考序列 (NC-000010.10)进行比对，进一步确认核苷酸变异信息。

1.2.4 突变分析 测序结果用Chromas软件分析，并与NCBI中的正常序列进行BLAST比对，分析采用在线软件分析蛋白的结构，检测保守区、功能区及多序列比对。在线分析软件为：0nline Mendelian Inheritance in man (OMIM)、1000 Genomes、PolyPhen 一 2、SIFT、SWISS.Model repository、PROSITE。

2 结果

测序结果提示患儿存在ERCC6基因复合杂合突变（表 1），Sanger测序(表 2)：对父母进行同片段序列分析结果显示，该患儿分别遗传了父亲及母亲的杂合突变，该患儿ERCC6复合杂合突变中核苷酸 变 化 c.116-1125delTGAGTATTTC、c.780-781insCC； 氨基酸变化：p.Ser372SerfsX30|p.S372SfsX30、p.ProfsX70|p.P260PfsX70； 基因亚区：EX5；CDS4，属框移突变，该框移突变导致氨基酸编码蛋白发生提前终止，产生截短蛋白，会对蛋白质的结果和功能产生较大影响；该突变在文献中未见报道；与CS发病有相关性。

3 讨论

CS是一组进行性加重的中枢神经系统遗传变性疾病，其发病机制是ERCC6、ERCC8基因发生突变，细胞内DNA受到损伤后，由ERCC6基因编码的CSB不能将损伤的DNA进行修复，并且以损伤的DNA作为模板进行mRNA转录并进行蛋白质翻译；ERCC8基因编码的CSA蛋白亦不能修复损伤的DNA，并且导致损伤的DNA累积，后续的转录及翻译过程终止，因此CS的临床表现可能是修复缺陷与转录缺陷共同作用的结果[7，8]。

表1 患儿ERCC6基因突变位点信息

表2 患儿父母Sanger验证位点信息

图1 （图1a为该患儿c.780-781insCC突变位置、图1b为该患儿c.116-1125delTGAGTATTTC突变位置）

该患儿出现的临床症状与报道的CS综合征患者的临床表现相同，但该患者还出现了腹泻，患儿还有一哥哥，其哥哥与该患儿的症状一致，亦出现腹泻，并且有肝衰竭（11岁时已死亡）。Cockayne综合征有三种临床分型[9]：1 型(OMIM：133540)为经典型，累及脑、眼、皮肤、骨骼等多个系统，出生时多正常，婴儿期或儿童早期发病，逐渐进展；2型(OMIM：216400)为先天型，表现更严重，出生早期就可能死亡；3 型（OMIM：216411）为温和型，特点是晚发病，病程进展缓慢，可以存活至成年，通过该患儿的临床表现提示为Cockayne综合征1型。目前国内外还未见Cockayne综合征1型生育后代报道[10]。

图2 （图2a该患儿母亲c.116-1125delTGAGTATTTC突变位置；图2b为该患儿父亲c.780-781insCC突变位置）

Cockayne综合征头部影像学检查最具特征性[11]，表现为双侧侧脑室扩大、脑萎缩和钙化、脑白质髓鞘形成不良等，该患儿头颅CT提示颅内广泛性钙化，符合其影像学改变。Cockayne综合征没有血生化以及代谢产物的特征性改变，因此主要通过临床表现及影像学的特征性进行临床诊断，再通过基因检测进行分子遗传学确诊[12]。

本研究中，我们对该患儿进行了ERCC6、ERCC8基因进行检测，患儿检测出了ERCC6基因的 c.116-1125delTGAGTATTTC（p.Ser372SerfsX30）及 c.780-781insCC（p.ProfsX70）突变，属于复合杂合突变。根据Sanger测序，c.116-1125delTGAGTA TTTC杂合突变来源于父亲，c.780-781insCC杂合突变来源于母亲，目前该突变国际上未见报道，属于新发突变。患儿及其哥哥均为Cockayne综合征患者，其父母表型正常，但为致病基因携带者。Cockayne综合征是一种严重致残致死性遗传疾病，目前没有有效的治疗办法，只能采取物理及支持治疗提高患者的生活质量，因此患该病儿给社会及家庭带来了沉重的经济及精神负担，及时的诊断及产前诊断是非常有必要的。该夫妇再次妊娠后患病风险1/4，致病基因携带者1/2，鉴于该夫妇已生育2个该病患儿，因此在妊娠11-14周采用胎儿绒毛膜绒毛取样（CVS）方法或18-24周采用羊膜腔穿刺术进行产前诊断，或者针对该检出的致病基因位点直接行胚胎遗传前诊断（PGD），以阻止此病在该家庭中继续蔓延。