结核与非结核病人感染凝固酶阴性葡萄球菌的耐药性及耐药基因mecA分析＊

王锦萍 ，王军 ，蔡常辉 ，梁连辉

(广东省中山市第二人民医院，1.检验科；2.门诊部，中山 528400)

结核是一种慢性传染性疾病，严重危害着人类的健康，据报道全世界每年新发生结核病800万-1000万，每年约有100万-300万人死于结核病。[1-3]2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示：全国15岁及以上人群活动性肺结核的患病率为459/10万，估算为499万例。[4]据报道，结核合并感染革兰氏阳性球菌中以CNS为主[5]，但在临床检测中经常把CNS当作非致病菌而漏检。为探讨结核合并感染CNS的耐药性，减少其多重耐药发生，为抗结核合并感染提供指导，本研究对比分析2014年11月至2016年3月本院结核合并感染CNS与非结核感染CNS的耐药情况，并检查其耐药基因mecA，报道结果如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 根据中华医学会制定的《肺结核诊断和治疗指南》中相关的诊断标准[6]挑选肺结核患者，其他部位结核按照临床诊断标准判断。2014年11月至2016年3月本院患者确诊CNS感染的99例患者中，按是否感染结核将患者分为A、B两组，A组(54株)为确诊结核病患者分离株，标本来源于痰液32株、血液7株、分泌物3株、胸水6株、尿液3株，脑脊液2株，大便1株，所占比例分别为59.3%、13.0%、5.5%、11.1%、5.5%、3.7%、1.9%。B 组(45株)为非结核病患者分离株。标本来源于血液22株、痰液7株、分泌物 7株、胸水3株，尿液 3株、大便3株，所占比例分别为48.9%、15.6%、15.6%、6.7%、6.7%、6.7%。卫生部购入质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923作室内质量控制。

1.2 主要仪器及试剂 PHOENIX-100型全自动微生物鉴定仪(美国BD公司)，革兰氏阳性鉴定药敏复合板(美国BD公司)；Cobas z 480 PCR扩增仪(瑞士罗氏公司)；B100生物安全柜(济南鑫贝西公司)；电泳仪(北京市六一仪器厂)；恒温金属浴仪(上海培清公司)；宝生物工程（大连）有限公司：购买蛋白酶K、EX Taq聚合酶、琼脂糖凝胶、DL2000 DNA Marker，合成PCR引物序列。

1.3 CNS鉴定及药敏试验 99株CNS经PHOENIX-100型全自动微生物鉴定仪 (美国BD公司)进行菌种鉴定及药敏敏感性试验。根据美国临床实验室标准化协会 （CLSI）2015年文件（M100-S25）进行药敏试验结果判读。

1.4 统计学处理 利用WHONET 5.4版软件对两组CNS药敏数据进行耐药性分析。采用SPSS 13软件包对两组数据进行统计分析，计数资料选用Z检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.5 耐药基因mecA检测

1.5.1 DNA引物 设计mecA基因引物[7]，序列长度533bp。 上游引物（5’3’）：AAAATCGATGGTAAAG GTTGGC；下游引物（5’3’）：AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC。

1.5.2 PCR提取与扩增试验 挑选纯培养物单个菌落于含有蛋白酶K溶液的离心管里，于金属浴中55℃消化1h，增加至95℃灭活10min，最后放进小型离心机中以12000r/min离心5min，留取上清液（DNA模板）存于-20℃冰箱待用[8]；取PCR扩增管加入 1μl DNA 模板，1μl上游引物，1μl下游引物，12.5μl EX Taq聚合酶，补充9.5μl灭菌纯水组成25μl反应体系；把含25μl PCR反应液的扩增管放入Cobas z 480 PCR扩增仪中扩增 （扩增系数：10min 94℃预变性、30s 94℃变性、30s 52℃退火、60s 72℃延伸，共30个循环；最后10min 72℃延伸）；PCR 产物在 4℃保存[9]。

1.5.3 电泳及成像 PCR产物与溴甲酚蓝指示剂混合后点样，进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像并拍照。

2 结果

2.1 PCR法检测耐药基因结果 采用PCR扩增法检测99株CNS的耐药基因mecA，部分结果见图1；A组54株结核合并感染CNS中检出mecA基因50株，检出率为92.5%；B组45株非结核感染CNS中检出mecA基因38株，检出率为84.4%。

图1 部分CNS的mecA基因PCR扩增产物电泳图

2.2 CNS的菌株类别（见表1）

2.3 CNS对抗菌药物的耐药率 采用PHOENIX-100型全自动微生物鉴定仪对A、B两组的CNS进行菌种鉴定及药物敏感性试验，药物敏感性试验为微量肉汤稀释法（MIC法），对表1不同菌种的药敏试验中挑选17种相同的抗菌药物进行对比。药敏结果显示，A组结核合并感染的CNS，耐苯唑西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）检出率为92.6%，青霉素耐药率达96.2%，红霉素、庆大霉素和四环素耐药率分别为85.2%、75.9%和25.9%；B组非结核合并感染CNS，耐苯唑西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）检出率为86.7%，青霉素耐药率达93.3%，红霉素、庆大霉素和四环素耐药率分别为80%、60%和20%；两组均未发现耐万古霉素耐药株，详见表2。采用秩和检验计算两组数据的耐药率 Z=-2.935，P=0.003＜0.05，差异有统计学意义，表明A组比B组耐药性高。

表1 CNS的菌株分类

表2 CNS对抗菌药物的耐药率

3 讨论

近年来由于结核耐药率逐渐增加，且结核患者由于营养状况，经济，依从性以及合并感染其他慢性疾病等因素，影响结核患者的预后[10]。而凝固酶阴性葡萄球菌为临床常见革兰氏阳性球菌，随着医院治疗中各种侵入性操作增多，大量使用激素和免疫抑制剂等因素，CNS已成为世界范围内医院感染的重要致病菌。[11]在结核合并感染革兰氏阳性球菌中，CNS占首位，且具有广泛的、严重的耐药性，本研究通过A组（结核合并感染）与B组（非结核感染）两组CNS对多种抗菌药物耐药性比较，采用统计学方法得出，结核合并感染的CNS比非结核感染的CNS耐药性更高，并具有显著性差异。而且对两组CNS均进行耐药基因mecA检测，检出率与耐药性相符。

从表2看，A组结核合并感染的54株CNS中，耐药率从大到少依次是：青霉素＞红霉素＞氨苄西林＞环丙沙星＞庆大霉素＞阿莫西林/克拉维酸＞克林霉素＞妥布霉素＞利福平＞复方新诺明＞四环素＞阿米卡星＞替考拉宁＞奎奴普丁/达福普汀＞万古霉素＞呋喃妥因；B组非结核感染的45株CNS中，耐药率从大到少依次是：青霉素＞红霉素＞氨苄西林＞环丙沙星＞克林霉素＞庆大霉素＞妥布霉素＞阿莫西林/克拉维酸＞利福平＞复方新诺明＞四环素＞替考拉宁＞阿米卡星＞奎奴普丁/达福普汀＞万古霉素＞呋喃妥因。除了替考拉宁、奎奴普丁/达福普汀和呋喃妥因A组比B组的耐药率低外，其他抗菌药物的耐药率均为A组比B组高。与相关报道一致[12，13]，万古霉素仍是治疗葡萄球菌的有效治疗抗菌药物。

PCR扩增法检测99株CNS的耐药基因mecA，了解β-内酰胺类药物耐药机制。本研究中从A组结核合并感染患者中分离的CNS中，PCR法与MIC法检出率均为92.6%，50株MRCOS检出了mecA基因；从B组非结核患者中分离的CNS中，PCR法检出率为84.4%，而通过MIC法检出率为86.7%，39株MRCOS只有38株检出了 mecA基因；PCR法检测B组MRCOS中有1株没有检出mecA基因，考虑与mecA基因存在异质性改变有关[14]，但两组MRCNS的耐药性及耐药基因检出率基本相符。因而可以推断mecA基因在结核和非结核感染的MCNS中有很高携带率，严重耐药性不容小觑。

MRCNS的耐药基因可分为：获得性基因mecA、获得性基因TEM基因，突变性基因fem基因，编码失常的sar基因、编码失常的arg基因和编码失常的mgr基因等等，导致葡萄球菌对β-内酰胺类药物耐药。产青霉素酶葡萄球菌通过破坏β-内酰胺环从而对青霉素耐药；MRSCNS多携带mecA基因，编码低亲和力青霉素结合蛋白2α（PBP2α），替代葡萄球菌青霉素结合蛋白 2（PBP2）完成肽聚糖和细胞壁的合成，细菌不仅没有被灭活而且因替换蛋白从而获得抗药性。据战晓薇[15]等报道，mecA基因多位于葡萄球菌染色体mec基因盒（SCCmec）中，其序列长度超过 30000bp，可携带mecA基因复合物、转座子和整合质粒的毒力岛，因此除引起β-内酰胺类药物耐药外，还会引起各种非β-内酰胺类药物耐药。相关报道[16]还显示，CNS具有较高生物被膜形成能力，绝大部分为MRCNS，且表现为多重耐药性。MRCNS不仅导致β-内酰胺类药物耐药，同时也导致大环内酯类和氟喹诺酮类药物耐药，因此，我们从临床分离的MRCNS均表现为广泛、多重耐药的特征，而结核合并感染的MRCNS对比非结核合并感染的MRCNS表现更为明显。结核病多以肺部感染为主，患者多表现为咳嗽咳痰、胸痛、低热等症状，经排除治疗未愈，通过CT、涂片等检查，再结合肺结核指南才可最后确诊，期间很长一段时间是通过抗生素治疗，常规经验性用药多采用β-内酰胺类药物、大环内酯类、氟喹诺酮类药物及广谱抗生素 （三代头孢），在广谱抗菌药物的筛选作用下容易产生耐药菌株定植；肺结核确诊后，需要长期使用抗结核药物治疗，患者肝肾损伤严重，免疫力低下，定植耐药菌株得以繁殖；加上侵入性治疗如支纤镜吸痰及糖皮质激素治疗等因素，均为MRCNS提供有利的生存条件。而非肺结核病的确诊难度比肺结核更高，临床医生排除时间更长，更有利于耐药菌株的产生。

综上所述，结核合并感染的CNS对比非结核感染的CNS，特别是MRCNS，PCR法与MIC法相互印证其准确性，而结核合并感染的MRCNS引发的多重耐药特性比非结核合并感染的MRCNS更强。耐药基因mecA是MRS的金标准，它不但可在同种细菌内传播，更可通过不同种类细菌间传播，必须警惕其严重的耐药性。