超声微泡造影剂携雷帕霉素对人膀胱肿瘤系T24细胞增殖及凋亡影响的实验研究

陈景林，陈锦涛，陈利武，曾今诚

(1.广东省汕头市潮阳区大峰医院，广东汕头 515100；2.广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 523808)

膀胱癌常见且治愈困难、死亡率高，一旦发生转移更是会威胁到人的生命健康[1]。近些年膀胱癌发病率一直居高不下[2]。手术治疗在早期患者的治疗中具有较好的疗效；但晚期以及术后复发的膀胱癌患者，常采用化疗，但所使用的药物昂贵、毒副作用大，患者身体痛苦程度高、心理压力大，治疗效果并不显著[3]。近期研究发现，雷帕霉素(rapamycin，RPM)又名西罗莫司(sirolimus)在膀胱癌的治疗具有明确疗效[4]。而本研究引入超声微泡造影技术，进一步分析RPM对膀胱癌的治疗机制以及超声微泡造影技术应用在膀胱癌的治疗当中的意义，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1实验材料细胞培养材料：人膀胱癌T24细胞株、细胞冻存培养基(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)-1640 培养基、胎牛血清分别购自上海弘顺生物科技有限公司、上海源叶生物科技有限公司和美国Thermo Fisher公司；药物RPM购自美国Biomil公司；检测试仪器和试剂：流式细胞仪和酶标仪分别购自美国Coulter公司和MD公司，四甲基偶氮唑盐法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)反应试剂和超声造影剂Bracco SonoVue(规格59 mg)分别购自购自北京赛因坦科技有限公司、TaKaRa Corporation和美国Sigma 公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及分组培养 在RPMI-1640 培养液中加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，并将T24细胞置于上述培养液于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。分组：将细胞随机分为对照组、RPM组和超声微泡造影剂携RPM组。① 对照组：接种细胞进入对数生长期后，不做任何处理，坚持每天换液；② RPM组：接种细胞进入对数生长期后，加入RPM 100 ng/mL；③ 超声微泡造影剂携RPM组：接种细胞进入对数生长期后，加入RPM 100 ng/mL的同时应用超声辐射。将超声照射时间、辐照声强、超声频率三项超声参数分别设定为10 s、0.5 W/cm2和300 kHz后，固定超声探头于24孔板底部进行超声照射，后加入RPM 100 ng/mL[5]。超声造影剂Bracco SonoVue和RPM分别用适量生理盐水和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，-20 ℃保存。

1.2.2细胞增殖实验 细胞增殖实验采用MTT比色法进行。胰蛋白酶消化处理后的对数期T24细胞按照每孔1 000个细胞(150 μL)接种于96孔板，相同条件下孵育24 h后弃去培养液。按照“1.2.1项”下不同组别的处理方案继续操作，每组细胞均设6个复孔，继续温育24 h后取出进行MTT比色分析。具体操作如下：各孔加入四甲基偶氮唑盐(MTT)(5 mg/mL)20 μL，培养4 h后弃培养液；每孔加DMSO 150 μL，避光摇晃混匀，室温放置15 min，采用酶标仪于500 nm波长下测定吸光度(A)值，重复操作3次。

1.2.3细胞凋亡实验 胰蛋白酶消化处理后的T24细胞转移至25 cm2培养瓶(106个细胞)中，按照“37 ℃、5%CO2培养24 h→4 ℃培养2 h”的顺序进行。弃去培养液后按照“1.2.1项”下不同组别的处理方案继续操作，3组细胞分别加入培养液、100 nmol/L RPM和100 nmol/L RPM各3 mL，培养箱中培养24 h后采用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗3次。向胰蛋白酶消化处理后T24细胞中加入2 mL枸橼酸溶液，经过“缓冲液冲洗2次→75%乙醇固定”操作程序后应用流式细胞仪检测细胞周期；按照“加PBS缓冲液→Annexin V室温避光30 min→加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)→避光反应10 min→加缓冲液”操作步骤后，采用流式细胞仪检测凋亡率和死亡率。每次实验重复检测3次。

1.2.4逆转录-聚合酶链反应法检测增殖细胞核抗原mRNA表达水平 增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的mRNA表达采用逆转录-聚合酶链反应(reversed transcript polymerase chain reaction，RT-PCR)法。接种细胞至6 孔板，每孔2 mL，3组细胞根据“1.2.1项”下处理方案继续操作，培养24 h后弃培养液，提取细胞总RNA后进行逆转录。用灭菌去离子水配置20 μ mol/L PCR反应引物，按照表1中PCR反应仪扩增步骤操作，其中第1～4步循环28次后72 ℃ 10 min终止反应。取PCR 产物5 μL，经20 g/L 琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL 溴化乙啶) 电泳，紫外成像后采用全自动图像分析系统处理。结果以内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的吸光度值进行标准校正后分析(表1)。

表1PCR反应仪增步骤

序号步骤温度(℃)时间1预变性943 min2变性9430 s3退火5430 s4延伸7230 s5终止7210 min

1.2.5Western blot测定PCNA的蛋白表达水平 采用Western blot测定PCNA的蛋白水平表达。将待测细胞裂解后，二喹啉甲酸(bicinchonic acid，BCA)法蛋白定量试剂盒定量，加入上样缓冲液混匀后加热变性；取等量蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)电泳分离，恒流300 mA 60 min 转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，电化学 (electrochemiluminescence，ECL) 发光，拍照存档。

表2PCR引物序列

目的基因扩增产物(bp)上游引物序列(5'～3')下游引物序列(5'～3')PCNA412GTGACTGGTTATCGTCCCTCCTTCAGCATTATCTTCAGCCCTTAGAPDH307CT CTGGAAAGCTGTGGCGTGATGGAAGAATGGGAGTTGCTGTTG

PCNA：增殖细胞核抗原；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

1.3统计学方法对从本次研究对象中获得的所有数据进行整理归纳，并采用SPSS19.0软件t检测对3组T24细胞增值、凋亡以及PCNA的mRNA及蛋白表达情况进行统计学分析和比较，其中P<0.05表示具有统计学差异。

2 结 果

2.1超声微泡造影剂携RPM对T24细胞增殖的影响对照组、RPM组和超声微泡造影剂携RPM组3组细胞的生长能力分别为1.065±0.026、0.816±0.021和0.512±0.013，可见，经过RPM和超声微泡造影剂携RPM处理过后的T24细胞生长能力明显下降，其中超声微泡造影剂携RPM组与空白对照组、RPM组存在显著差异(P<0.05)。

2.2超声微泡造影剂携RPM对T24细胞周期分布与凋亡的影响流式细胞仪检测结果表明经RPM和超声微泡造影剂携RPM处理过后的处于G1期的T24细胞数量明显高于对照组(P<0.05)，并且T24细胞出现大量凋亡(表3，图1)。

组别G0/G1SG1/M对照组72.5± 1.3520.73±0.966.93±0.31RPM组75.2±1.5718.02±0.814.78±0.27超声微泡造影剂携RPM组78.9±1.8212.32±0.782.28±0.11

图1RPM处理、超声微泡造影剂携RPM细胞影响的流式细胞仪周期检测结果

A：RPM处理；B：超声微泡造影剂携RPM。

图2 PCNA-mRNA RT-PCR 产物琼脂糖电泳图

1：250bp和500 bp DNA条带；2:对照组PCNA和GAPDH mRNA 表达情况(上面为PCNA，下面为GAPDH)；3、4：RPM以及超声微泡造影剂携RPM处理后mRNA 表达情况。

3 讨 论

超声微泡造影剂是一种新型超声应用材料，有助于肿瘤的早期诊断及靶向治疗，在膀胱肿瘤临床应用中较为普遍[6]。主要是应用高灵敏度、高分辨率的实时超声造影对膀胱肿瘤的形态、大小及肿瘤浸润程度进行检查和诊断[7]。有研究发现，高强度超声可以崩解纳米微泡从而增加细胞膜的通透性，为膀胱癌的靶向治疗提供依据[8]。RPM属于大环内酯类抗生素，最早20世纪80年代便作为一种新型免疫抑制剂并应用于器官移植后的免疫排斥反应的治疗方面[9]。近些年多项研究表明，RPM可以通过作用于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)而抑制多种肿瘤的生长，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、诱导细胞凋亡等多种作用[10]。因此，本课题重点研究超声微泡造影剂携RPM在膀胱癌治疗当中的优势以及作用机制，为临床上进一步的研究和应用提供有力依据。

郭贺丰等[11]研究发现，雷帕霉素能够明显抑制PC-3细胞生长能力，其抑制能力与作用时间和药物浓度呈现依赖性，同时也可以抑制PC-3细胞的分裂和增值；单广夷等[12]研究发现，雷帕霉素对T24 细胞的增殖抑制作用和体外细胞侵袭能力的抑制作用呈现出剂量依赖性。本研究发现，经RPM处理后的RPM组T24细胞的细胞增值能力下降，出现大量凋亡，多数细胞增殖停滞在G1期，与上述研究结果具有一定程度的相似性。其主要原因是RPM进入细胞后通过与基质中小分子蛋白结合成复合物，进一步结合mTOR，阻断mTOR通路，切断增殖信号，控制mTOR介导的肿瘤细胞G1-S期的增殖，从而使大部分细胞周期停滞在G1期，最终阻碍肿瘤细胞的增殖[13]。PCNA 作为DNA 多聚酶δ的辅助亚单位，在细胞分裂过程DNA的合成过程中发挥辅助作用，可作为细胞增殖的重要标志[14]。本研究发现，RPM处理过后的RPM组的mRNA和蛋白的表达明显下降，可见细胞增殖也处于一个停滞阶段，肿瘤细胞基因表达并不活跃。王建波等发现雷帕霉素在大鼠胸主动脉平滑肌瘤细胞PCNA-mRNA 的表达过程当中发挥抑制作用，其抑制能力随药物浓度增高其抑制作用增强，进一步佐证了上述结果。

另外，超声微泡造影剂携RPM组细胞用MTT法测定的T24细胞增长水平明显低于RPM组，以及凋亡情况明显高于RPM(P<0.05)；相对于RPM组，其PCNA的mRNA及蛋白的表达情况也明显较低(P<0.05)，可见，超声微泡造影剂能够增强RPM对于膀胱肿瘤细胞的抑制效果，分析其主要原因在于超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下，微泡可以通过机械机制、空化机制、热机制而发生“快速膨胀—收缩—破裂”一系列的变化，增加细胞膜通透性，从而使造影剂进入细胞内的RPM更加广泛、快速而准确的发挥作用，从而抑制膀胱癌T24细胞的增殖情况[15-16]。

综上所述，超声微泡造影剂携RPM相较于单独应用RPM作用效果更加明显，能够使药物准确且快速的发挥疗效，从而抑制膀胱肿瘤T24细胞的生长和繁殖；并通过与mTOR蛋白的作用而使得大部分细胞停滞在G1期，加快细胞的凋亡。超声微泡造影剂携RPM在膀胱癌的治疗当中具有很好的临床应用前景。