细菌外膜囊泡与抗生素相关的研究进展

程谦 吴疆 王岱

(厦门大学分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室，厦门 361102)

革兰阴性菌细胞膜包含大量的蛋白质，有着重要功能，如营养获取、黏附、分泌、信号传递和应对环境压力等，细胞膜的破坏对于细菌来说是致命的。为了适应环境，革兰阴性菌进化出了一种在不破坏细胞膜情况下也能分泌出来的来源于细胞膜的球状小泡，其中含有DNA、RNA、周质蛋白、毒力因子，病原相关分子模式(PAMPs)和其他外膜成分。由于其通常来源于细菌外膜，故又称为细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)[1-2]。细菌外膜囊泡既不同于传统的分泌系统，也不同于细胞裂解及凋亡的产物。越来越多的研究者开始将细菌外膜囊泡视为一种新的分泌系统，认为其能介导细菌中蛋白质、磷脂和核酸等生物大分子的转运，从而导致毒力和致病能力的提高、影响宿主的生理病理过程[2]。病原微生物与感染性疾病严重威胁人类健康，目前抗生素依然是感染性疾病治疗的主要手段。有研究表明抗生素可以影响细菌外膜囊泡的合成及分泌，反过来外膜囊泡对细菌在抗生素环境下的存活、耐药性的获得等也有作用。但是国内关于此方面的报道不多。故本文从细菌外膜囊泡与抗生素的角度出发，对细菌外膜囊泡这种新的分泌系统、抗生素对细菌外膜囊泡影响及细菌外膜囊泡应用等方面进行综述，以期对后续研究提供帮助。

1 细菌外膜囊泡

病原微生物严重威胁人类健康，一部分原因在于原核生物进化出了各种各样巧妙的分泌途径来帮助其完成感染及致病。除了经典的一型到六型分泌系统，细菌在生长过程中能够不断地从外膜上产生直径在20～250nm的外膜囊泡[3]。细菌外膜囊泡是一种新型分泌系统的观点得到了越来越多的认同。细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是一种直径为20～250nm，可通过巨胞饮、小窝蛋白、网格蛋白和脂筏介导的内吞作用运输至宿主胞内或者胞外特定部位进而发挥生物学作用的活性物质[4]。囊泡运输途径相较于其他分泌系统有许多优点：它们可以装载各种类型的物质，从蛋白类大分子毒素到疏水性小分子；对囊泡内装载物有一定保护作用；并且囊泡运输途径可以实现其他分泌系统难以做到的长距运输[5]。

1.1 细菌外膜囊泡的产生

电子显微镜的出现使得细菌超微结构的研究得以展开。自从1963年与1965年的报道显示革兰阴性菌囊泡的存在，越来越多的研究表明革兰阴性菌分泌囊泡状物质是一种普遍现象[6-9]。细菌外膜囊泡是球状膜囊泡，其形成过程与细胞应激密切相关(例如暴露于抗生素压力下)。目前国际上关于细菌外膜囊泡形成机制有几种解释，包括局部膜重塑，脂多糖、肽聚糖及周质空间膨压的改变。最早之前，Burdett等[10]和Hoekstra等[11]关于OMVs生物发生的研究表明，肽聚糖(PG)和细菌外膜之间交联的减少引发它们的形成。Mashburn等[12]提出当细菌外膜磷脂，脂多糖和其他特定分子富集时细菌外膜的曲率变化导致OMVs产生。在铜绿假单胞菌上完成的工作揭示了由群体感应分子PQS插入细菌外膜后会导致OMVs产生[13-14]。其他像正电荷化合物、螯合剂EDTA、改变外膜蛋白稳定性还有高温、抗生素压力等环境因素也会导致OMVs的产生[1,15-17]。这些模型的共同假设是OMVs从外膜区域突出，肽聚糖与外膜之间交联的破坏或者膨压的增加导致外膜与肽聚糖层的解离。

1.2 细菌外膜囊泡的组成

由于细菌种类的不同以及细菌各自生态区位的差异，其外膜囊泡也展示出了不同的组成。虽然普遍认为细菌外膜囊泡来源于外膜和周质而不是内膜或细胞质，但越来越多的证据表明OMVs中携带脂多糖(LPS)、磷脂、肽聚糖、外膜蛋白(OMPs)、细胞壁、蛋白质(周质、蛋白质和膜结合)、核酸(DNA和RNA)等成分，并且OMVs除了经典的直径20～200nm不等的球状结构外，在其他细菌中还发现了管状和细长型结构[18-19]。随着蛋白质组学分析技术的进步，在OMVs中已经鉴定出了很多属于不同的功能类别蛋白质[20]，例如大肠埃希菌MG1655中就鉴定出了几百种蛋白质其中包括一些蛋白酶和肽酶。Horstman等[21]报道甘油磷脂，磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺和双磷脂酰甘油是产肠毒素大肠埃希菌OMVs中主要脂质，其与OMVs的曲率相关。也有报道称OMVs中存在一些不是细菌外膜成分的脂质[22]。除了蛋白质及脂质成分，外膜囊泡腔和表面还携带相关的DNA和RNA，比如质粒和噬菌体DNA。但核酸掺入OMVs的实际机制仍不清楚，有研究者猜测核酸可能是细菌裂解残留物掺入OMVs中随机带入，也有一些学者认为其生物发生过程并不是偶然[23-24]。

1.3 示踪OMVs运输途径的研究方法

目前已经知道的OMVs进入宿主细胞的途径有巨胞饮、小窝蛋白、网格蛋白和脂筏介导的内吞作用等[25]。但是探究OMVs进入宿主细胞后具体的作用靶标及信号通路依然是一个难题。为了找到一种快速高效的追踪囊泡传递效应物的方法，研究者们进行了很多尝试。Bauman等[26-28]研究者利用染料对外膜囊泡进行标记，这种染料可以实时显示OMVs进入宿主细胞、传递装载物质的过程，但这些染料也可能改变囊泡成分及生化特征导致实验误差。Martina等[29]研究者利用免疫学方法标记与OMVs相关表位，这种方法特异性很好，但需实验前先将细胞进行固定并且纯化OMVs相关抗体。Kaparakis等[30-31]研究者利用宿主细胞表型上的特异性改变作为囊泡运输毒素进入胞内的一种指示。这种方法仅适用囊泡进入细胞后有能观测到明显的标志性特征。最近，O'Donoghue研究团队[32]提出了一种以囊泡靶向探针为导向的高灵敏度实时探究囊泡进入宿主细胞动力学的方法。他们发现细菌细胞壁的组成会影响囊泡的摄取途径以及后续的进入动力学和摄取效率，并且脂多糖O抗原的存在使囊泡可以绕过网格蛋白介导的内吞从而提高它们进入宿主的效率。这些快速高效的研究囊泡进入宿主并传递效应物的方法是后续研究OMVs对宿主相关影响的基础。

2 细菌外膜囊泡与抗生素

OMVs已被证明含有一系列膜相关蛋白，周质蛋白和细胞质成分，涉及重要的生物功能，包括信号传导、应激反应、群体感应和毒力。越来越多的研究表明细菌外膜囊泡与抗生素之间密切相关。并且，抗生素治疗引起的氧化应激反应及细菌外膜囊泡的产生有可能导致机体细菌感染的加重。

2.1 抗生素压力刺激OMVs的分泌

抗生素压力刺激可以调节OMVs的产生。肠出血性大肠埃希菌易造成严重的细菌感染并引发危及生命的溶血性尿毒综合征。研究表明，环丙沙星，美罗培南，磷霉素和多黏菌素B能刺激肠出血性大肠埃希菌O104:H4和O157:H7中外膜囊泡的产生，并且环丙沙星还能上调OMVs中肠出血型大肠埃希菌主要毒力因子志贺毒素2a的产生。这些作用可能会恶化临床上产志贺毒素大肠埃希菌造成的感染[33]。研究者的数据同时进一步支持了现有“应避免抗生素治疗此类致病菌感染”的建议。随着对常用抗生素头孢菌素和碳青霉烯类耐药的菌株的流行率增加，疾病的负担和复杂性也随着增加。

因此，必须了解致病菌感染发病机制及抗生素耐药机制，以获得替代的干预策略。庆大霉素是一种重要的抗生素，常与其他抗生素联合用于治疗严重的败血症。还有研究者探究了临床上相关的应激诱导条件下肠外致病性大肠埃希菌临床分离株促炎性外膜囊泡的产生和组成，发现当庆大霉素敏感菌株暴露于一系列不同浓度庆大霉素时，其外膜囊泡颗粒丰度有了增加；相反，在庆大霉素抗性菌株中则没有观察到增加。可以说，OMVs的产生是革兰阴性细菌应激反应的一部分，用来提高细菌在抗生素环境压力下的存活能力[34]。

2.1.1 抗生素处理引起的细菌包膜应激

抗生素处理引起细胞被膜压力增加，例如研究者Kadurugamuwa等[35]发现多黏菌素和庆大霉素可以通过外膜的起泡而促进外膜囊泡形成，研究者Manning等[36]也证明了OMVs可以作为中和噬菌体和膜靶向抗生素的诱饵，从而帮助细菌细胞抵抗抗生素压力。同样，在铜绿假单胞菌中也发现庆大霉素能够结合并破坏铜绿假单胞菌的细菌外膜，从而导致OMVs的释放[37]。

2.1.2 抗生素处理引起的SOS应答

抗生素治疗有时候会因为诱导SOS反应和促进细菌的囊泡增加从而加重细菌感染。SOS反应是一种通过转录水平的应答[38]，当使用引起DNA损伤型抗生素特别是喹诺酮类药物如环丙沙星处理细菌时通常会引起SOS反应。SOS反应又可以触发由前噬菌体编码的内溶素的表达，从而引起裂解刺激囊泡形成。例如铜绿假单胞菌会通过SOS响应来刺激外膜囊泡的产生[39]。研究者Maredia等[40]发现喹诺酮类药物环丙沙星刺激下的铜绿假单胞外膜囊泡脂质和细胞毒性水平均增加。然而，在无法激活SOS反应的铜绿假单胞缺陷菌株中，环丙沙星应激期间囊泡分泌的增加受到抑制，这表明SOS反应在OMVs生物发生中的重要作用。使用丝裂霉素C处理痢疾志贺菌也会激活其SOS反应，导致志贺毒素相关的OMVs水平增加，毒力增强。并且这种压力诱导下的囊泡增加也可以促进大肠埃希菌的存活率[41]。有趣的是，环丙沙星诱导分泌的外膜囊泡与亚胺培南诱导的外膜囊泡相比，在形态和蛋白含量方面存在显著差异。这些研究结果暗示不同类型的抗生素可能诱导产生不同的外膜囊泡。

2.1.3 抗生素抑制细胞壁合成，促进囊泡的形成

β-内酰胺类抗生素可以通过阻断肽聚糖合成来破坏细胞壁完整性，在细菌肽聚糖层中产生空穴，细胞质膜及内含物可以通过这个空穴突出到细胞外空间从而刺激革兰阳性细菌细胞质囊泡的形成[3,42]。

2.2 OMVs在抗生素压力下的保护性

2.2.1 OMVs能与氨基糖苷类抗生素结合

在环境中通常存在着几种细菌群体共存的情况，研究者使用来自大肠埃希菌MG1655的OMVs处理铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌，发现其显示出了膜活性抗生素如黏菌素、蜂毒肽、多黏菌素B处理下的保护性[43]。这种保护是通过隔离或降解膜活性抗菌分子来实现。然而，大肠埃希菌的OMVs不能保护任何这些细菌免于其他抗生素如环丙沙星、链霉素和甲氧苄啶的杀伤作用[2,36]。OMVs可以帮助细胞生存的第二种可能机制是通过OMVs的外膜来结合氨基糖苷类抗生素。研究表明，OMVs可以帮助抵抗多黏菌素，因为这种抗生素与OMVs结合后变得不稳定。类似的，暴露于庆大霉素后细菌释放的OMVs可以通过在OMVs被转运到胞质溶胶之前脱落上面结合的抗生素来帮助细菌增大存活的机率。释放的OMVs还可以通过结合或吸收抗生素从而清除外部环境中的抗生素。

2.2.2 OMVs中含有具有活性的酶

早些时候已经发现OMVs中含有β-内酰胺酶，肽酶，蛋白酶和其他裂解酶等[44-47]，这些酶在OMVs中的稳定存在暗示了其在抗生素方面的可能作用。近期对多重耐药嗜麦芽寡养单胞菌的研究表明，β-内酰胺类抗生素会诱导其分泌更多的囊泡，并且分泌的OMVs被证明可以降解细胞外环境中的β-内酰胺类抗生素[48]。研究者还发现在β-内酰胺抗性大肠埃希菌的OMVs中，几种可能参与降解β-内酰胺类抗生素的蛋白质含量更高，因此，来自β-内酰胺抗性大肠埃希菌的OMVs可直接和剂量依赖性地降解β-内酰胺抗生素，并使β-内酰胺敏感的大肠埃希菌和其他细菌免受β-内酰胺抗生素引起的生长抑制。这些结果表明来自β-内酰胺类抗性大肠埃希菌的OMVs在β-内酰胺类抗生素敏感细菌的存活中起重要作用。这一发现可能为抗击当前全球抗生素耐药性扩散提供一种新思路[49]。

2.2.3 OMVs可以增强药物外排能力

生物膜是细菌产生的一种具有保护作用的表面黏附结构，其中含有多糖、脂质、核酸、蛋白、鞭毛、菌毛和OMVs等物质。生物膜对细菌的生存以及耐药性的获得十分重要。在细菌生物膜中，OMVs是重要的成分。很多研究报道OMVs与铜绿假单胞菌生物膜的关联[50-52]，可以设想在这种浓缩的OMVs环境中，通过这种基于囊泡作用的机制可以进一步增强微生物生物膜的作用从而帮助细菌抱团抵抗抗生素[1,50-51]。更重要的是，OMVs相关的多种药物外排泵有助于易感细菌在抗生素环境中的短暂存活。药物外排泵(efflux pumps)是存在于细菌细胞膜上的一类蛋白质。研究发现，许多细菌可以通过外排泵系统将进入胞内的抗菌药物泵出胞外，从而使菌体内药物浓度降低而导致耐药[53]。在Kim等[49]的研究中，当大肠埃希菌处于抗生素压力环境下OMVs的产生可以通过去除错误折叠的蛋白质、排出抗生素来帮助细胞存活更长时间。细菌外膜囊泡相当于给细菌药物外排泵提供了一种有利武器。

2.2.4 OMVs介导细菌耐药性的扩散

核酸的细胞间转移是细菌进化的固有特征，这种转移可以通过自然转化，结合和转导完成。很早就有研究表明在淋病奈瑟球菌中，含有青霉素抗性基因的质粒被转移到青霉素敏感的淋球菌中[54]。近些年研究也进一步证实了细菌分泌的纳米管及外膜囊泡也能帮助细菌完成耐药基因的转移和扩散。例如黏膜炎莫拉菌的OMVs能够将β-内酰胺酶蛋白转移到肺炎链球菌和流感嗜血菌中，从而促进它们在阿莫西林存在下的存活[55]。鲍曼不动杆菌外膜囊泡中含有编码β-内酰胺酶的blaOXA-24基因而具有青霉素类和头孢类抗生素抗性，并且随着外膜囊泡的排出导致碳青霉烯耐药的转移[51]。

3 OMVs在减少抗生素耐药方向的应用

抗生素耐药在全球范围内都是无法忽视的难题，如何延缓抗生素耐药情况的恶化以及找到新的抗菌途径是当前研究的热点。OMVs具有多种生物学和病理生理功能，在抑制细菌疾病复发及抵抗抗生素耐药方面具有巨大潜力。例如来自拟杆菌的OMVs口服后可以通过肠黏膜屏障到达下面的上皮细胞和巨噬细胞[56]。有研究者提出利用天然衍生的OMVs的生物相容性和固有抗生素药物载体的特性，将抗生素递送到感染部位。例如将抗生素掺入纳米颗粒药物载体作为一种增强抗菌效力及克服某些微生物耐药性作为一种新的药物开发策略。这种方式可以保护抗生素免于降解并减少副作用，但还需提高其靶向致病菌的选择特异性。目前利用OMVs的生理特性已经实现了向组织递送一系列治疗性物质(siRNA、microRNA和蛋白质)[57]。除此之外，研究者发现来自黏细菌的OMVs抑制大肠埃希菌的生长与临床建立的抗生素庆大霉素程度相当，同时液相色谱耦合质谱分析显示在OMVs中存在抑菌成分。这项工作可以作为进一步评估来自黏细菌的OMVs作为抗细菌感染的新型治疗递送系统的重要基础[58]。另一方面，因为OMVs对于宿主中细菌的存活及致病是必需的，所以外膜囊泡的调控也可以成为抗生素开发的潜在靶标。

4 展望

细菌外膜囊泡在解决细菌耐药这一难题方面有巨大潜力。尽管已有很多研究表明OMVs可以保护细菌免受抗生素的伤害，但很少详细说明其保护的方式和程度。并且对于细菌外膜囊泡与抗生素相关的研究尚未系统化，抗生素进入外膜囊泡的具体机制以及OMVs对细菌的保护性是否具有特异性或偏向性也有待阐明。未来，抗生素、细菌外膜囊泡及生物被膜之间联系的阐明将有助于破解细菌耐药性难题。