糖尿病肾脏疾病中的自噬分子调控机制

王 艳 ，彭 亮 ，王 倩 ，赵海玲 ，李 平 ★

（1.中国医学科学院 北京协和医学院研究生院，北京 100730；2.中日友好临床医学研究所 免疫炎性疾病北京市重点实验室，北京 100029；3.北京中医药大学，北京100029）

自噬（autophagy）是一种高度保守的降解方式，利用溶酶体降解、选择性清除自身受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器，释放出游离小分子供细胞回收利用，一方面在生理状态或病理状态下，降解错误折叠或衰老的蛋白质和受损伤的细胞器等来维持细胞内环境稳定，另一方面在营养缺乏等条件下，降解大分子物质，为细胞提供所必需的氨基酸和能量[1]。

在肾脏中，自噬主要发生于足细胞及近端肾小管细胞，其他细胞如系膜细胞也呈现微弱自噬活性[2]。足细胞呈现较高水平的基础自噬活性，而近端肾小管基础自噬活性较低，仅在应激时呈现自噬活性升高。两者自噬活性易受营养状态影响，多与代谢疾病有关，是近年来糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）研究的热点问题[3]。

1 自噬的种类

根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式，哺乳动物自噬可分为 3种主要方式：巨自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）及分子伴侣介导自噬（chaperonemediated autophagy，CAM）。前2种进行选择性和非选择性降解胞内蛋白、细胞器，CAM则需待降解蛋白在结合分子伴侣后，转入溶酶体降解[4]。其中，巨自噬是最常见的自噬，本文主要介绍巨自噬的发生及调控机制，下文提到的自噬为巨自噬。

2 自噬的发生过程

真核细胞巨自噬发生过程分为3个阶段：（1）吞噬泡（phagophore）阶段：在营养缺乏缺乏、体液因子缺乏、缺氧、DNA损伤、蛋白质错误、线粒体损伤、病原体感染等刺激下，粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体的部分双层膜脱落形成自噬前体，自噬前体包绕需降解蛋白质、细胞器和部分胞质，形成杯状吞噬泡；（2）自噬体（autophagosome）阶段：吞噬泡不断延伸，完全包绕需降解的蛋白质、细胞器，形成封闭自噬体；（3）自噬溶酶体（autolysosome）阶段：自噬体通过微管系统与溶酶体融合形成单层膜的自噬溶酶体，内膜及其内成分降解，自噬体膜脱落循环利用[1]。

3 自噬发生的分子机制及其调控靶点

3.1 自噬发生的分子机制

当细胞处于饥饿状态时，细胞内Unc-51样激酶1/自噬相关基因Ⅰ（unc-51-like kinase 1/autophagy-related genes1，Ulk1/Atg1）首先结合 Atg13、FIP200（Atg17），构成Ulk1复合物，激活Ulk1色氨酸/酪氨酸蛋白激酶，催化自噬起始。继而，Beclin-1（Atg6）、Atg14、hVps15 与 III型磷脂酰肌醇3激酶（class III phosphatidylinositol-3 kinase，PI-3K/hVps34）结合构成PI-3K复合物，磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）生成磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate，PIP3），招募多种定位自噬前体，促进前体成核。

自噬前体延伸形成吞噬泡与吞噬泡闭合形成自噬体，涉及Atg12、微管相关蛋白轻链3（microtubule associated protein light chain 3，LC3/Atg8）泛素样蛋白及其连接过程：（1）Atg12 形成（Atg12-Atg5-Atg16）2六聚体复合物，促进自噬前体延伸，并招募LC3-Ⅱ自噬体定位；（2）胞浆LC3裂解为胞浆水溶性LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ结合磷脂酰乙醇胺，形成脂溶性LC3-Ⅱ，转位固定于自噬前体内膜，继续招募新生LC3-Ⅱ。由此可见，LC3-Ⅱ表达量升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达量比值升高，可以反映自噬活性升高。

胞浆中需降解的蛋白经泛素化蛋白、p62/SQSTM1蛋白标记后，再通过p62/SQSTM1蛋白结合LC3-Ⅱ进入自噬溶酶体并最终被降解代谢。当细胞自噬障碍，p62/SQSTM1蛋白不能正常降解，在胞内聚集，可以在一定程度上反映自噬活性下降[5]。但需注意，自噬流过度活化时由于自噬体和自噬溶酶体的代偿性增加，也有可能导致p62/SQSTM1含量增加，因此不能单纯通过p62/SQSTM1表达量来确定自噬功能和自噬流状态。

3.2 自噬发生的调控靶点

当机体处于糖尿病状态时，自噬起始主要由异常糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢调控。胞内低浓度氨基酸可直接激活Ulk1，诱导自噬。而低浓度葡萄糖主要通过腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信号通路，激活Ulk1，其自噬强度远高于雷帕霉素诱导自噬；当葡萄糖浓度升高时，自噬可以经负反馈调节被抑制[6]。另外，一些特殊蛋白也可调控自噬。p32蛋白结合Ulk1，增强其稳定性，敲低p32会促进Ulk1的K48位泛素化，同时抑制Ulk1的K63位泛素化，最终导致了Ulk1降解。进一步研究发现，敲低p32明显抑制饥饿诱导的细胞自噬以及解偶联剂诱导的线粒体自噬；此时，补充外源Ulk1，可以恢复细胞自噬与线粒体自噬。

自噬溶酶体形成时，构象异常的蛋白质、受损的细胞器等在胞内积聚，影响正常自噬流，其主要机制涉及以下3个环节：（1）自噬体形成受阻，当PI-3K活性被3-甲基腺素（3-methyladenine，3-MA）抑制后，ATP 供能不足、自噬前体成核障碍，自噬流早期即被阻断，LC3-Ⅱ、及其与LC3-Ⅰ比值可正常或稍降低，p62/SQSTM1含量明显上升；（2）自噬溶酶体成熟受阻，自噬溶酶体的成熟过程涉及自噬体与溶酶体的融合，以及融合后的酸化，融合期间需骨架蛋白微管重新聚合和H+-ATP酶连续供能，长春碱、诺考达唑和巴佛洛霉素A1可抑制微管聚合、H+-ATP酶活化，期间也可因H+-ATP酶失活，导致自噬溶酶体酸化障碍，此时LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，p62/SQSTM1含量快速上升；（3）自噬溶酶体降解受阻，氯喹及其衍生物羟化氯喹等弱碱性物质可趋向进入溶酶体，破坏溶酶体酸性环境，抑制异常蛋白、细胞器正常降解，导致自噬溶酶体肿胀并于细胞内堆积，LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及p62/SQSTM1含量变化趋势同（2）[7]，反之，自噬溶酶体降解的增强反而可引起LC3-Ⅱ的降低。

4 DKD自噬中的营养物质敏感信号通路及其调控靶点

4.1 雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路

健康状态下，肾小球足细胞通过维持低水平mTOR基础活性和高水平基础自噬活性以促进细胞更新。而在DKD早期，mTOR可适度激活，在一定程度上保护足细胞免受损伤，利于蛋白合成、足细胞的修复。DKD进展时，mTOR的过度激活则会抑制自噬，导致足细胞自我更新不足、空泡化、足突融合，以及后期的足细胞数目减少和蛋白尿[7]。mTOR是DKD中足细胞的重要自噬调控因子。

细胞内主要有2种mTOR复合物（mTOR complex，mTORC）：对雷帕霉素敏感的mTORC1、对雷帕霉素不敏感的mTORC2。真核生物中，mTORC1活性主要由PI-3KAkt-TSCl/2-mTOR信号通路调节。

mTOR通路调控机制：（1）足细胞内营养缺乏时，Atg13去磷酸化，参与Ulk1复合物形成；胞内营养充足时，Atg13结合3个磷酸集团，干扰Ulk1复合物形成，直接抑制自噬起始[8]。（2）足细胞内能量充足时，mTORC1与Ulk1复合物结合，磷酸化Ulk1残基Ser757，抑制Ulk1激活，抑制自噬起始[9]。（3）在机制（2）中，Ulk1 的过度磷酸化，可干扰其结合AMPK，抑制AMPK诱导自噬。（4）足细胞自噬产生的亮氨酸、精氨基酸，可以作为终产物负反馈调节自噬；胞内亮氨酸浓度升高，活化GTP酶，如小G蛋白——脑中Ras同源物（ras homology enriched in brain，Rheb）和丝裂原活化蛋白 4激酶（mitogen-activated protein 4 kinase 3，MAP4K3），继而激活mTORC1，负反馈抑制自噬，而当亮氨酸浓度下降则抑制mTORC1活性，但亮氨酸调节GTPase和MAP4K3的作用机制尚未明确。（5）协同溶酶体表达和调控基因网络的主要转录因子TFEB（transcription factor EB），mTORC1磷酸化胞浆TFEB Ser 211，使其滞留胞内无法向胞核转送，核内TFEB浓度降低，其溶酶体相关蛋白表达降低，溶酶体酸性环境维持障碍，抑制自噬溶酶体形成[10]；此外TFEB正向调控自噬相关蛋白，磷酸化TFEB后，自噬抑制。

4.2 AMPK信号通路

当肾脏细胞内葡萄糖不足、ATP浓度下降、ATP/AMP浓度比值下降，AMPK可经磷酸化激活，诱导自噬起始。糖尿病（diabetes mellitus，DM）状态下，AMPK 经去磷酸化失活，提高AMPK活性，有利于自噬恢复。

AMPK通路调控机制：（1）低浓度葡萄糖可直接磷酸化足细胞内Ulk1，诱导低水平自噬，但Ulk1主要激活途径为AMPK通路，AMPK磷酸化Ulk1多个位点，激活Ulk1，直接诱导自噬[11，12]。（2）AMPK 磷酸化 Raptor脱离mTORC1复合物可间接诱导自噬。（3）HEK293细胞内葡萄糖缺乏或AMP/ATP值升高时，AMPK活化并磷酸化TSC2，增强 TSC2对 Rheb抑制，抑制 mTOR通路活化[13]。（4）AMPK 可通过（2）、（3）抑制 mTORC1 磷酸化 Ulk1 Ser757，促进AMPK结合并磷酸化Ulk1，诱导自噬起始。（5）以低糖刺激原代大鼠系膜细胞，AMPK磷酸化激活JNK1（Jun NH2-terminal kinase 1），JNK 磷酸化 Bcl-2（bcell lymphoma），解离Beclin-1-Bcl-2复合物，释放 Beclin-1促进PI-3K复合物形成，诱导自噬[14]。（6）AMPK控制叉头转录因子（forkhead transcription factor，FOXO）表达，同时促进FOXO1、FOXO3结合相应基因，促进 LC3、Atg12、Bnip3等自噬相关蛋白表达，需注意FOXO3与基因的结合可被Akt抑制[14]。（7）AMPK活化可使胞内NAD+浓度升高，激活沉默信息调节因子（silent information regulator 1，Sirt1）。其中，AMPK磷酸化Raptor，是其抑制 mTORC1关键机制。此外，在AMPK信号通路中，调节p27蛋白稳定性可以影响自噬进行，p27蛋白存在时发生自噬，p27蛋白缺失时，细胞则发生凋亡。

由上可知，mTOR信号通路与AMPK信号通路对自噬的调控作用相反，当肾脏细胞内营养不足时，AMPK通路活化，抑制mTOR通路；当营养条件改变时，AMPK通路活性可降低，而mTOR通路活性升高。

4.3 Sirt1信号通路

Sirt1是依赖NAD+的去乙酰化酶，可以通过多种途径调控自噬。当能量不足、NAD+/NADH比值升高时，Sirt1被激活，释放抗氧化物质，修复DNA损伤，维持端粒稳定，同时增强自噬功能。除此之外，Sirt1活化后亦可调控自噬发生过程去乙酰化 Atg5、Atg7、LC3、FOXO1、FOXO3，活化FOXO1、FOXO3，促进BNIP3基因转录和Bnip3蛋白表达，Bnip3结合Bcl-2，释放Beclin-1，诱导自噬。而在DM状态下，足细胞、肾小管上皮细胞内Sirt1活性下降，以上机制被抑制，应激诱导性自噬活性降低，细胞损伤、衰老加快。在应用Sirt1激动剂白藜芦醇后，自噬活性可以部分恢复，细胞损伤减轻，蛋白尿减少、肾小球基质扩展减轻，肾损伤延缓[15～17]。

因此，Sirt1不仅可以保护肾脏细胞并通过调控自噬改善DKD的进程，而且对于胰岛素分泌和降糖作用有着积极的影响[18]，调节Sirt1的药物可能成为治疗胰岛素抵抗和治疗DKD的双重调节药物。

4.4 张力蛋白同源磷酸酶（phosphatase and tensin homology，PTEN）通路

PTEN是一种PIP3磷酸酶，其功能与PI-3K相反，可将细胞膜上的PIP3去磷酸化转变为PIP2，抑制AktmTOR通路，促进自噬。原代人肾小球系膜细胞在高糖状态或TGF-β刺激下，microRNA-21表达上调，与PTEN mRNA的3’UTR结合增多，抑制PTEN蛋白表达的作用增强，从而激活Akt-mTOR通路[19，20]。在应用熊果酸或PI-3K抑制剂LY294002后，microRNA-21表达受到抑制，自噬活性有一定程度恢复[21]。此外，microRNA-216、microRNA-217也参与调控PTEN表达[22]。

5 DKD自噬与应激代谢

足细胞是一种不能增殖的终末分化细胞，对于外界应激较为敏感，当应激超过代谢能力，足细胞自身稳态被破坏，细胞结构受损、足突融合，滤过膜受损，致尿蛋白出现。肾小球滤出蛋白流经近端肾小管上皮细胞，可被其重吸收，上皮细胞长期摄入过量蛋白质，应激储备能力较弱，亦对应激敏感。高血糖状态下，细胞内常积聚活性氧（reactive oxygen species，ROS）、糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）等，细胞可产生适应性调节，及时清理积聚物来维持稳态。应激时发生的代谢机制多与自噬有关，了解两者关系，对于预防DM引起的肾损伤具有重要价值。

5.1 晚期糖基化终末产物

高糖状态下，肾小球内皮细胞、足细胞自噬处于抑制状态，胞内大分子蛋白质、核酸等非酶糖基化加快，快速增加的AGEs不能经自噬降解，在细胞内积聚。AGEs结合并活化晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE），激活 PKC，ROS 生成增多，诱发氧化应激、异常自噬以及细胞内环境紊乱。此外，直接以AGEs刺激原代大鼠肾小球内皮细胞，TAGE-RAGERhoA/ROCK通路活化，细胞骨架蛋白F-actin发生异常重排，内皮细胞滤过率增加，肾小球炎症加重；给予丹酚酸A治疗后，RAGE表达下降，滤过率与炎症可明显缓解，同时一定程度上恢复自噬功能。

5.2 内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）

缺氧可通过未折叠蛋白反应（unfold protein response，UPR）引起ERS，UPR主要涉及3种成分——转录因子6（transcription factor-6，ATF6）、蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）和肌醇依赖酶 1（inositol requiring enzyme1，IRE）。UPR激活2条通路——IRE1-JNK通路和PERK-eIF2α（翻译起始因于2的α亚单位，eukaryotic initiation factor-2α）通路。IRE1-JNK 通路磷酸化Beclin-1，促进吞噬泡成核。PERK-eIF2α通路活化ATF4，促进吞噬泡延伸和自噬体形成。研究表明，在原代人肾小管上皮细胞中，环孢素通过ERS激活自噬，保护细胞免受环孢素损伤[23]。但是在足细胞中，糖尿病、高血糖可通过ERS抑制足细胞自噬，引起足细胞损伤，在应用TUDCA（牛磺脱氧胆酸）缓解ERS后，自噬活性恢复，足细胞损伤减轻[24]。

5.3 氧化应激

糖尿病状态下，AGEs增加、PKC过度活化、多元醇途径激活导致机体产生大量ROS，在胞内积聚产生氧化应激。当氧化应激损伤HEK293细胞线粒体时，PTEN介导的推定激酶 1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）结合且磷酸化Parkin，活化PERK-eIF2α通路，激活Atg4蛋白酶从而加快LC3蛋白裂解，同时抑制mTOR活性，激活自噬，清理受损线粒体[24]。但若氧化应激过度，激活的自噬不足以清理受损线粒体，线粒体积聚不断产生ROS，线粒体损伤进入恶性循环。

5.4 缺氧

缺氧在DKD发展中扮演重要角色。缺氧时，低氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）激活靶基因BNIP3表达，Beclin-1生成增多，加强竞争性结合Bcl-2，释放Beclin-l激活自噬[25]。

6 小结与展望

综上所述，肾脏细胞自噬的异常改变与DKD发生发展密切相关。在肾脏中，自噬与营养物质敏感信号通路、应激代谢密切相关，对于维持肾脏内环境稳定至关重要。而糖尿病时，机体处于高血糖状态，肾脏处于营养过剩状态，自噬受抑制，错误或衰老蛋白质、细胞器在胞内积聚。当机体处于饥饿状态时，自噬可一定程度恢复，及时清理代谢胞内积聚AGEs、毒性蛋白、受损线粒体等，维持细胞正常稳态。另外，DKD自噬中涉及的调节机制，为干预DKD发生发展和治疗DKD提供了新方向，比如人为干预营养状态，限制能量，增强自噬，保护肾脏，预防DKD和阻断DKD进展，同时新药研发应以部分抑制mTORC1活性为目的，避免mTORC2抑制引起细胞骨架损伤、足细胞结构破坏等副作用。