高效液相色谱法测定通络通散中柯里拉京的含量

梁莹莹 ，李 丽 ，赫 军 ，张淑君 ，马秉智 ，王晓雪 ，刘 晓 ★

（1.中日友好医院 药学部，北京 100029；2.北京工商大学 北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 100048）

通络通方为我院中西医结合肿瘤内科常用的中药验方，外用具有温经通络、活血化瘀之功效，能显著改善化疗引起的病理性神经性疼痛[1～3]。通络通散是对该验方进行二次开发后研制的制剂，由老鹳草、淫羊藿、红花等中药组成，制成散剂，方便患者携带[4]。老鹳草作为方中的君药，其药材通用检测成分为没食子酸。但经过初步试验结果显示，没食子酸在该处方分析中存在干扰，而柯里拉京是其特征性成分[5]，专属性强，能作为该制剂的质量控制指标，故本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对其制剂的指标性成分柯里拉京进行含量测定，为通络通散质量控制方法的建立提供科学依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪，CPA225D十万分之一电子天平（德国斯多利斯仪器系统有限公司），KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

通络通散（批号 20150123、20150205、20150219）为中日友好医院中药制剂室自制；柯里拉京（批号：111623-201308）购自中国食品药品检定研究院。试验中所用乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[6，7]与系统适应性试验

色谱柱为 Waters Symmetry C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.01mol/L 磷酸氢二钾溶液（用磷酸调节 pH 至 2.14）（9：91，V/V）；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：40℃；进样量：10μl。在上述色谱条件下，柯里拉京的保留时间为10.4min，组分分离良好，且其它成分无干扰。理论板数以柯里拉京峰计≥5000；分离度＞1.5。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取15.79mg柯里拉京对照品，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取本品0.1g，置于50ml具塞锥形瓶中，精密加入50%丙酮溶液10ml，称定重量，超声（功率：240W）提取0.5h，放冷，再称定重量，用50%丙酮溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

取不含老鹳草的其他药味各适量，按通络通散的处方比例及制备工艺制成缺老鹳草的阴性样品，再按“2.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察

图1 高效液相色谱图

分别精密吸取“2.2”项下柯里拉京对照品溶液 0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml置于 10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列对照品溶液。分别精密吸取系列对照品溶液各10μl，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以柯里拉京的峰面积积分值（y）为纵坐标，质量浓度（，μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=40754.3736x-47.6917，r=0.9999。结果表明，柯里拉京的质量浓度在7.90～505.28μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

表2 3个不同批号通络通散中柯里拉京的含量（n=3）

2.6 精密度试验

精密吸取同一柯里拉京对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，结果RSD为1.46%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密称取通络通散置于50ml具塞锥形瓶中，按 “2.3”项下方法配制供试品溶液，于制备后0，2，4，6，8，10，12 h 时分别按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录柯里拉京峰面积，结果RSD为0.97%（n=6），表明供试品溶液在12h内稳定。

2.8 重复性试验

精密称取通络通散置于50ml具塞锥形瓶中，按“2.3”项下方法配制供试品溶液，共制备6份，按“2.1”项下色谱条件测定柯里拉京的含量，结果平均含量为 4.57mg/g，RSD 为 1.38%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知柯里拉京含量的通络通散适量，共6份，分别精密加入相当量的柯里拉京对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表1。

2.10 样品含量测定

分别精密称取不同批号的通络通散约0.1g，各3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“1.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算样品中柯里拉京的含量，结果见表2。

3 讨论

通络通散为我院在研制剂，老鹳草为方中君药，柯里拉京是其特征性成分，专属性强，能作为该制剂的质量控制指标。柯里拉京具有抗癌活性，其对神经胶质瘤、肝癌等作用机理研究确切[8～11]，可以确定其为活性成分。但老鹳草成分复杂，通络通散作为复方制剂，其药效的物质基础尚待进一步研究，尚不能以偏概全，以柯里拉京为本制剂的全部有效成分。本实验选取了老鹳草主要特征成分柯里拉京作为质量控制指标，建立了通络通散中柯里拉京的含量测定方法。通过紫外光谱扫描发现，柯里拉京的最大吸收波长在220nm处，与文献报道一致[6]，故选用220nm为检测波长；关于提取方法，由于制剂中其它组分对柯里拉京的干扰较大，故笔者参照文献[2]，分别考察了烘干后甲醇提取、50%甲醇提取和50%丙酮提取3种方法，结果表明50%丙酮提取能有效除去杂质，排除干扰，对柯里拉京的提取率高，重现性好，便于医院制剂的常规检验工作，为最佳提取方法。