正交试验法优选海南黎药冰糖草茎叶中总黄酮成分的提取工艺＊

鱼清雅，郭从嘉，毕 进，张思程，符亮明，侯 杰，陈丽珍

海南医学院药学院（海口571199）

冰糖草是玄参科植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，为多年生草本植物，资源丰富，主要分布于海南、广西、广东、福建、台湾等地，其性凉，味甘，是一味常用民族药；具有清热解毒，疏风止咳，利尿消肿之效，用于肺热咳嗽、脚气浮肿、湿热黄疸、皮肤湿疹、暑热吐泻、高血压和丹毒等病证［1－2］。国内外有少量文献对冰糖草全草的化学成分、药理活性、生药学等方面进行了研究，表明黄酮类化合物为其主要有效成分之一，是一种极具开发应用前景的中草药［3－5］。在海南岛，黎族民间常用冰糖草的茎和叶治疗咽喉炎、跌打损伤等症；目前关于海南黎药冰糖草的研究报道比较少，研究内容主要是其质量控制方面［6］。总黄酮成分广泛存在于植物体内，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化自由基、镇痛抗炎、保肝和保护心血管系统等多种生理活性［7－8］；且绝大多数以苷的形式存在，少数以游离的苷元形式存在。因结构及存在状态不同其溶解度有很大差异，提取方法也不尽相同，其中超声波提取以其选择性高、快速高效、有效成分提取率较高、适于热不稳定物质等优点为众多科研工作者所采用［9－12］。由于乙醇毒性较小，安全性高，对天然植物细胞的穿透能力较强，且乙醇提取液不易发霉变质，故本实验选择乙醇作为提取溶剂。本实验采用正交试验法对海南黎药冰糖草茎叶中总黄酮的提取工艺进行研究，为海南黎药冰糖草茎叶中有效成分的提取提供参考。

材料与方法

1 材料

1.1 原料与试剂：冰糖草采自海南省万宁市龙滚镇，经海南医学院药学院曾念开教授鉴定为玄参科植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，分取茎叶部分，烘干，粉粹并过80目筛，密封低温干燥避光保存备用。芦丁标准品（上海源叶生物科技有限公司，编号B20771），硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇为分析纯；水为双蒸水。

1.2 仪器与设备：DFY－1000D型封闭式粉碎机（温岭市林大机械有限公司），DHG－9075A电热干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），SK3210HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），SHZ－D循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），RE－2000B型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），AE100电子分析天平（上海梅特勒－赛托利多仪器有限公司），UV－1600型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）。

2 试验方法

2.1 芦丁标准曲线的建立［4－5］：精密称取干燥至恒重的芦丁标准品12.30mg，用70%乙醇溶解，并定容至50ml容量瓶，摇匀，即得芦丁标准溶液。精确吸取0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml的芦丁标准溶液分别置于25ml容量瓶中，各依次加入5%亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀静置6min；加入10%硝酸铝溶液1.0ml，混匀静置6min；最后加入4%氢氧化钠溶液4.0ml，加双蒸水定容，混匀静置15min，以溶剂空白为参比，于510nm处测定吸光度A。以芦丁浓度C为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A＝10.677C－0.0028，R2＝0.9996。表明芦丁在4.9～78.7μg／ml范围内呈良好线性关系。

2.2 样品的提取与测定：准确称取黎药冰糖草茎叶粉末约4.0g于磨口三角瓶中，在设定的试验条件下按一定的乙醇浓度、液料比、超声温度、超声时间和超声功率进行超声波提取，固定提取次数为2次，抽滤，合并2次滤液，定容于容量瓶中，摇匀即得待测样品溶液。精确量取一定量样品溶液，按照标准曲线的方法测定吸光度，并计算得黎药冰糖草茎叶中总黄酮得率。

2.3 单因素试验：在其他条件：乙醇浓度70%、液料比20∶1ml／g、超声时间40min、超声温度50℃、超声功率250W相同的情况下，分别考察超声温度（35、40、45、50、55、60℃）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1ml／g）、超声功率（125、150、175、200、225、250W）、乙醇浓度（40、50、60、70、80、90%）、超声时间（20、40、60、80、100、120min）对海南黎药冰糖草茎叶中总黄酮得率的影响。

2.4 正交试验及验证：为了系统考察海南黎药冰糖草茎叶中总黄酮的超声波辅助乙醇提取法的工艺参数，在单因素试验各因素对提取得率影响的大小、各因素的变化范围和各因素的最佳值的基础上，以总黄酮得率为考察指标，设计了L16（45）正交试验对黎药冰糖草茎叶中总黄酮提取方法的工艺条件进行优化，并确定与验证最佳提取工艺条件。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

结 果

1 单因素试验

1.1 液料比的影响：液料比对黎药冰糖草茎叶中总黄酮得率的影响结果见图1。随着液料比的增加，总黄酮得率也逐渐升高；当液料比达到30∶1ml／g后，继续增加液料比，提取得率开始下降。这是由于在总黄酮提取过程中，增加液料比能够增大原料与提取液的接触面积，也能增大溶液的渗透压，有利于总黄酮的渗出，因此乙醇浓度较低时，底物浓度较高，二者不能充分反应，冰糖草茎叶中的大部分总黄酮无法扩散到溶液中；随着乙醇浓度增加，总黄酮提取得率则明显增加。而液料比过大会影响多糖和蛋白的扩散速率和溶出平衡，最终干扰总黄酮的提取。故应选择左右为宜。故选择液料比为20∶1、25∶1、30∶1、35∶1ml／g作为正交试验的四个水平较为合适。

图1 液料比对黄酮得率的影响

1.2 超声温度的影响：超声温度对黎药冰糖草茎叶中总黄酮得率的影响结果见图2。随着超声温度的升高，总黄酮得率逐渐增加，当温度大于55℃以后提取得率开始稍微下降。这是由于随着温度的升高，物质扩散速度加，分子运动加剧，有利于黄酮的提取。但是温度过高，影响黄酮结构的稳定，一些热敏性的黄酮逐渐分解，继而导致得率下降。故选择超声提取温度为45、50、55、60℃为正交试验的四个水平较为合适。

图2 超声温度对黄酮得率的影响

1.3 超声时间的影响：超声提取时间对黎药冰糖草茎叶中总黄酮得率的影响结果见图3。在20～80 min的超声时间内，随着时间的增大提取得率随之增加，但超过80min后提取量增加较小并呈大幅度下降趋势。这可能是由于冰糖草茎叶中其他成分的溶出，干扰总黄酮的提取。故选择超声提取时间为20、40、60、80min为正交试验的四个水平较为合适。

1.4 乙醇浓度的影响：乙醇浓度对黎药冰糖草茎叶中总黄酮得率的影响结果见图4。在40～70%的乙醇浓度时，随着乙醇浓度的增加提取得率有较显著的增加，且在乙醇浓度为70%时达到最高；随后继续增大时则呈下降趋势。这是由于适当提高乙醇浓度可以加速黄酮的溶出，而乙醇浓度过高会导致溶剂的极性下降，进而使一些黄酮苷的溶解度下降，干扰黄酮的提取。故选择乙醇浓度为60、70、80、90%作为正交试验的四个水平较为合适。

1.5 超声功率的影响：超声功率对黎药冰糖草茎叶中总黄酮得率的影响结果见图5。随着超声功率的升高，总黄酮提取得率呈先增加后减少的趋势，当超声功率为175W时，得率最高；继续升高超声功率，得率开始下降。因此，超声功率选择175、200、225、250W为正交试验的四个水平较为合适。

图3 超声时间对黄酮得率的影响

图4 乙醇浓度对黄酮得率的影响

图5 超声功率对黄酮得率的影响

2 正交试验结果与验证

2.1 正交试验结果：正交试验结果及数据分析见表2。

由表2可知，不同因素水平对海南黎药冰糖草茎叶中总黄酮提取得率有不同影响，从极差R值可知，5个因素对总黄酮得率的影响大小依次为D＞A＞B＞C＞E，即乙醇浓度对总黄酮得率的影响最大，其次是液料比、超声温度和超声时间，超声功率的影响相对较小。正交试验中，黎药冰糖草茎叶中黄酮得率最高的是第10组，高达25.33mg／g，从各因素的不同水平看，A因素和D因素第3个水平最好，B因素第2个水平最好，C因素和E因素第4个水平最好，所以最优工艺组合为A3B2C4D3E4，即液料比30∶1ml／g、超声温度50℃、超声时间80min、乙醇浓度80%、超声功率250W。

通过直观分析，E因素影响不显著，故以E因素作为误差进行方差分析，结果见表3。由表3可知，因素A（液料比）和因素D（乙醇浓度）具有显著性；因素B（超声温度），因素C（超声时间）、因素E（超声功率）均不具有显著性。说明在海南冰糖草茎叶中总黄酮的提取工艺中，乙醇浓度和液料比是影响总黄酮得率的主要因素，在工艺优化中应该重点考虑。

2.2 最佳提取工艺的验证：在最佳工艺条件下做5次平行试验，所得黎药冰糖草茎叶中总黄酮得率分别为25.32、25.15、25.40、25.48、25.43mg／g，平均得率为25.36mg／g，比正交试验中的任何一次试验的得率都高，标准偏差为0.13%，相对标准偏差（RSD）为0.51%。由此表明正交试验得到的最佳工艺条件结果可靠，重现性好，且比较稳定。

表3 方差分析结果

表2 L16（45）正交试验结果

讨 论

本研究采用超声波辅助乙醇提取海南黎药冰糖草茎叶中总黄酮成分，在单因素试验的基础上，应用正交试验设计对冰糖草茎叶中总黄酮成分的提取工艺进行了优化，以期能为合理开发利用冰糖草奠定基础。研究结果显示，海南黎药冰糖草茎叶中总黄酮成分的最佳提取工艺为液料比30∶1ml／g、超声温度50℃、超声时间80min、乙醇浓度80%、超声功率250W，在此条件下经验证试验所测得总黄酮得率为25.36mg／g，且该最佳工艺重现性好，较为稳定。因此，正交试验法优化后确定的黎药冰糖草茎叶中总黄酮成分的超声波辅助提取工艺简单可靠，提取得率较高，经济方便，具有快速、高效等优点。为进一步研究开发利用海南黎药冰糖草资源提供了实验参考和理论依据。