氙气预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞保护作用研究

朱 婧，郭建丽

1.陕西省人民医院麻醉科(西安710068);2.内蒙古鄂尔多斯市中心医院麻醉科(鄂尔多斯 017000)

急性心肌梗死是严重威胁人类健康及导致人类死亡的心血管疾病。介入、溶栓及搭桥术是目前临床常用的治疗急性心肌梗死的手段，可及时恢复病变区血流再灌注，挽救濒死心肌细胞；然而缺血区血流再灌注有时会加速心肌死亡，扩大梗死区面积，引发心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。以往诸多研究显示，MIRI不仅局限于局部组织，且会对远隔器官组织造成影响，从而影响患者预后转归[1-3]。因此，如何预防MIRI及其对远隔器官组织的影响成为目前国内外研究热点。报道显示，可通过抑制心肌缺血再灌注损伤机体心肌细胞凋亡及机体氧化应激反应等途径，保护心肌细胞。近年来，多项研究显示，麻醉药物、尤其是吸入性麻醉药物预处理MIRI具有很好的保护作用。氙气是麻醉效果良好的理想型吸入惰性气体。大量研究证实，氙气预处理具有很好神经及心脏保护作用[4-5]。因此研究拟通过观察氙气预处理对MIRI大鼠心肌细胞凋亡和氧化应激反应的影响，探讨氙气对MIRI大鼠心肌细胞的保护作用及机制。

材料和方法

1 实验材料 己糖激酶(K-H)液、0.5倍肺泡最小有效浓度(Minimum alveolar concentration，MAC)氙气饱和K-H液，即40%氙气+35%氮气+25%混合气体饱和K-H液、1 MAC即75% 氙气+25%氧气混合气。成年雄性SD大鼠64只，体重265～350 g，由第四军医大学动物实验中心提供。采用随机抽签方式将其均分为四组，每组16只：假手术组(S组)、MIRI组(模型组)、0.5 MAC疝气预处理+心肌I/R组(0.5 XR组)和1 MAC疝气预处理+心肌I/R组(1 XR组)。

2 动物处理

2.1 MIRI模型制备：SD大鼠采用腹腔注射剂量为50 mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉，待麻醉成功后将其固定于手术台上，剪毛消毒后切开大鼠右颈，分离总动脉备用；切开暴露气管组织，内置气管套管，随后连接动物呼吸机进行正压通气通气(呼吸频率约60～70次/min)，于其四肢皮下接通电极，与BL-420S型生物机能系统进行连接以持续记录大鼠心电图。在大鼠胸骨左缘部位做纵向切口，并在第5肋间开胸，打开大鼠心包，充分暴露心脏；之后采用6-0号无损伤缝合线在左耳下缘2 mm处穿过左冠状动脉前降支，使心肌缺血30 min，松开结扎线后再灌注120 min。MIRI模型制备成功的标注为：缺血时局部心肌组织呈苍白、发绀状，心电图监测显示ST段明显抬高或出现T波高耸；缺血区在出现血流再灌注后心肌组织转红，心电图监测中所出现的明显抬高的ST段下降50%以上。

2.2 实验处理：S组大鼠开胸后至穿线不进行左冠状动脉前降支的结扎，持续150 min；模型组则在结扎左冠状动脉前降支使心脏缺血30 min后，松开结扎线使血流再灌注120 min；0.5 XR组采用0.5 MAC氙气预处理60 min，分4个循环，每个循环用含有0.5 MAC氙气的K-H液灌注5 min，然后再用纯K-H液进行10 min的洗脱，4个循环结束后进行左冠状动脉前降支的结扎缺血处理30 min，复灌注120 min；1 XR组则使用1 MAC氙气的K-H液进行预处理，预处理过程同0.5 XR组。

3 观察指标

3.1 心肌梗死面积评估：再灌注结束，每组取4只大鼠阻断左冠状动脉前降支，通过颈内静脉注射伊文斯蓝，心肌正常区发生蓝染，快速取出心脏并分离出左心室，并将心室横断成2 mm厚的组织块；同时分离出正常的蓝染组织。将未发生染色的危险区组织置于0.5%TPT中，并于37℃条件下水浴处理15 min，10%福尔马林进行24 h固定。梗死区则发生染色呈现灰白色，于显微镜下对其进行切割称重。心肌梗死范围=梗死区心肌质量/危险区心肌质量×100%

3.2 心肌细胞凋亡：再灌注结束，每组取4只大鼠处死，快速切除心脏并分离出左心室。使用细胞凋亡测定试剂盒测定心室内凋亡心肌细胞数量，细胞核为蓝色的属于正常细胞，棕黄色为凋亡阳性细胞。标本切片于400倍镜下随机取5个视野进行细胞计数。心肌细胞凋亡指数为凋亡细胞总数占总细胞数的百分比。

3.3 血清生化指标：再灌注120 min后取4只大鼠，经腹部取其主动脉血样5 ml， 3000 r/min条件下，4℃冷冻离心15 min，获得血清-20℃保存用于测定血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、一氧化氮合酶(eNOS)活性。CK、CK-MB、eNOS测定均选择免疫荧光法，其中CK、CK-MB试剂盒基蛋生物科技股份有限公司，eNOS试剂盒购自于南京信帆生物技术有限公司。

3.4 氧化应激指标：再灌注结束，每组4枚心脏中取其左室固定部位心肌组织0.5 cm×0.5 cm×1 cm，做匀浆处理，取10%的匀浆液置于4℃低温离心机中进行离心，2000 r/min条件下离心8 min。采用黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性，选择硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)采用双抗体夹心法测定。所用试剂盒均购自于上海纪宁实业有限公司。

结 果

1 四组大鼠再灌注120 min后心肌梗死范围和细胞凋亡指数对比 见表1。与S组相比，模型组心肌梗死范围明显增大，心肌细胞凋亡指数显著升高(P<0.01)；与模型组比，0.5 XR组和1 XR组大鼠心肌梗死范围显著缩小，心肌细胞凋亡指数显著下降(P<0.05)。但0.5 XR组和1 XR组大鼠心肌梗死范围和心肌细胞凋亡指数间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 四组大鼠再灌注120min后心肌 梗死范围和细胞凋亡指数对比(%)

注：与对照组比， *P<0.01；与模型组比，#P<0.05

2 四组大鼠心肌组织中SOD、MDA、GSH-PX含量对比 见表2。与S组相比，模型组大鼠心肌组织中SOD、GSH-PX含量显著减少，MDA含量显著增加(P<0.01)；与模型组比，0.5 XR组和1 XR组大鼠SOD、GSH-PX含量显著增加，MDA含量显著下降(P<0.05)。但0.5 XR组和1 XR组大鼠心肌组织中SOD、MDA、GSH-PX含量间差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 四组大鼠心肌组织中 SOD、MDA、GSH-PX含量比较

注：与对照组比，*P<0.01；与模型组比，#P<0.05

3 四组大鼠再灌注120 min后血清CK、CK-MB、eNOS活性对比 见表3。与S组相比，模型组大鼠血清CK、CK-MB活性显著增强，eNOS活性显著下降(P<0.01)；与模型组比，0.5 XR组和1 XR组大鼠CK、CK-MB活性显著降低，eNOS活性显著增强(P<0.05)。但0.5 XR组和1 XR组大鼠血清CK、CK-MB、eNOS活性间差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 四组大鼠再灌注120min后血清 CK、CK-MB、eNOS活性对比

注：与对照组比， *P<0.01；与模型组比，#P<0.05

讨 论

MIRI是一个涉及细胞凋亡、氧化自由基产生、诸多炎症介质和免疫因子释放等过程的复杂性病理反应。缺血再灌注后抗氧化物质大量消耗，氧自由基等毒性产物大量积累，破坏心肌细胞结构，激活机体炎症反应，造成心肌进一步损伤，最终导致心肌细胞凋亡加速，梗死范围扩大。预先对脏器做短暂的缺血再灌注处理后，通过调节机体炎症介质释放，激活神经传导通路等，可提高器官组织的抗MIRI能力，此方法即为缺血预处理。目前，缺血预处理被认为是临床中有效的内源性保护机制。许多实验证实，挥发性麻醉药物预处理具有一定器官组织保护作用。

氙气临床特性接近理想型吸入麻醉药物，其血气分配系数较低，因此对心血管系统的抑制作用相对较小。贾平等研究显示，不同时相氙气预处理均可降低肾脏缺血再灌注损伤[6]。众所周知，miRNA参与多种器官IRI的发展和缺血预处理的保护作用。Jia通过miR-21体内敲除和miR-21靶通路分析来确定氙气预处理对于肾脏IRI的保护作用，结果发现氙气预处理2 h可对肾脏IRI提供形态学和功能性保护作用[7]；Li等研究表明，75%氙气预处理可可通过阻断IRI引起的线粒体结构改变，开放mitoKATP通道，从而显著改善兔模型心功能，缩小其心肌梗死面积，减少细胞凋亡，抑制CK-MB释放[8]；Liu等发现，氙气处理通过激活AKT和ERK信号通路，减轻大鼠脊髓IRI程度[9]。IRI会导致心肌组织细胞中SOD、GSH-PX等自由基清除酶含量下降，导致机体氧自由基大量堆积；进一步脂质过氧化反应导致机体MDA含量增加；eNOS为调节NO合成的限速酶，NO具有扩张血管、抑制炎症细胞功能，改善冠脉血液供应的内源性信号分子，具有很好的保护心肌内皮细胞的功效[10]。同时，心肌缺血还会对细胞膜造成损伤，使得通透性增加，从而导致CK、CK-MB释放至血液，因此血清中CK、CK-MB含量也是反应心肌细胞损伤程度的良好指标。本研究选择阻断左冠状动脉前降支的方式造成大鼠缺血30 min，之后恢复灌注120min获得MIRI模型。研究结果显示，与S组比，模型组心肌梗死范围显著增加，心肌细胞凋亡指数明显升高，心肌组织中SOD、GSH-PX和血清eNOS活性显著下降，MDA含量显著增加，血清CK、CK-MB活性显著增强，提示MIRI模型制备成功。笔者在预实验基础上，参照文献选择0.5 MAC氙气和1MAC氙气进行预处理。结果提示氙气可通过抑制大鼠MIRI后氧化应激反应，抑制心肌组织进一步损伤。但0.5 XR组和1 XR组大鼠各指标间差异无统计学意义。

综上所述，氙气预处理可通过抑制大鼠机体氧化应激反应，减少心肌细胞凋亡数目及心肌梗死面积，降低CK及CK-MB释放，从而达到保护心肌细胞的预处理功效。但加大氙气使用百分比后对心肌细胞保护作用有限。