重组新城疫病毒疫苗rl-RVG对A549荷瘤小鼠瘤体生长的抑制作用

贾丽娟，杜苏丰

西安市胸科医院呼吸科(西安 710100)

随着社会的发展，肿瘤的发病率逐年增长，呈上升趋势，在当今的21世纪，严重的威胁着人类的身体健康，降低了人类的生活质量,尽管积极采用化疗、放疗及手术等方式治疗，但肺癌患者的5年生存率依然不高。自20世纪60年代初次记录新城疫病毒(Newcastle disease vires，NDV)可以在肿瘤细胞中复制并对肿瘤细胞具有杀伤作用以来，学者们总是在尝试将NDV应用于恶性肿瘤的治疗[1]。大量的临床实验研究显示，NDV是安全、有效的。NDV在肿瘤治疗中是具有广泛应用前景的，目前国内外NDV用于肺癌治疗的研究甚少。本研究拟运用稳定表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒疫苗(Recombinant avirulent NDV La Sota strain expressing the rabies virus glycoprotein，rl-RVG) 对人肺腺癌A549荷瘤鼠进行研究,探讨其对肺腺癌生长的发展及可能机制。

材料与方法

1 材 料 rl-RVG与NDV由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室惠赠；实验小鼠购自扬州大学；人肺腺癌A549细胞为本室保存；DMEM及胎牛血清购自维森特公司；小鼠抗狂犬病毒ERA株G蛋白一抗购自美国Santa Cruz公司，鸡抗LaSota株NDV一抗由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室惠赠，山羊抗鼠二抗购自北京康维世纪有限公司，兔抗鸡二抗购自Earthox公司，小鼠淋巴细胞分离液购自南京凯基生物科技发展有限公司，Anti-mouse CD3e PE购自美国 eBioscince 公司；FITC anti-mouse CD49b购自美国biolegend 公司。

2 研究方法

2.1 A549荷瘤鼠的建立：取30只4周龄裸鼠，体质量18～22 g。人肺腺癌A549细胞复苏后移入含有10 %胎牛血清和双抗的DMEM 中，37℃，5%CO2培养。待细胞生长至指数期，胰酶消化后收集，PBS配制成5×108/ ml浓度。每只小鼠腋下皮下注射0.3 ml A549悬液，经10 d左右，每只小鼠皮下均长成直径为5～20 mm的瘤体。

2.2 实验分组：将成瘤的裸鼠平均分为三组，每组10只，随机分为rl-RVG组(实验组)，NDV组(实验组)及对照组，分别于瘤体注射rl-RVG 6.3×108pfu，NDV 6×107pfu，PBS液300 μl。每周2次，持续3周。自第一次注射日(0 d)开始，每7 d测量小鼠肿瘤体积。第21 d时小鼠全部处死，钝性剥离瘤体，并取肺及脾等，一部分用4%低聚甲醛固定，另一部分于-80℃保存备用。

2.3 肿瘤生长曲线及抑瘤率：自第1次注射日(0d)开始，每7d分别用游标卡尺测量瘤体短径(a)及长经(b)(包括皮肤厚度在内)，计算瘤体体积(V)：V=a2×b×0.52，并绘制肿瘤生长曲线。根据末次肿瘤体积计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组平均肿瘤体积-实验组平均肿瘤体积)/对照组平均肿瘤体积×100%。

2.4 RT-PCR检测RVG及NDV HN基因表达：取小鼠新鲜皮下瘤体，TRIZOL法提取瘤体组织总RNA，以Oligo dT为反转录引物用Fermentas反转录试剂盒反转录成cDNA模板，引物分别为：RVG：上游5'-AGCCGATGCACTACAAG-3'，下游5' -CTGGAGGAGGGATGATTGC-3'，扩增长度：175 bp；NDV HN：上游5'-CTGGACGGTTTGGTGGGAA-3'，下游5'- TAATGCGACTGCGGGATGTG- 3'，扩增长度：462 bp，进行PCR，PCR的循环条件：94 ℃ 热启动预变性5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s(NDV HN为55 ℃ 30 s)，72 ℃ 30 s ,共30个循环，72 ℃延伸10 min，对扩增产物进行10 g/L琼脂糖电泳分析。

2.5 蛋白印迹法检测皮下瘤体组织RVG、NDV蛋白表达：取小鼠新鲜皮下瘤体组织，提取组织蛋白后，行SDS-PAGE电泳，转膜后分别使用鼠抗G蛋白一抗，鸡抗NDV一抗，稀释比为1∶500，按1∶10 000分别稀释山羊抗鼠IgG抗体，兔抗鸡IgG抗体为二抗,行蛋白质印迹检测.

2.6 流式细胞术检测rl-RVG转染后脾NK细胞(CD3+CD49b+)数 ： 取脾脏研磨成脾细胞悬液，用0.83%TrisNH4Cl破坏红细胞，PBS(pH=7.4)洗涤3次，染色缓冲液调整细胞浓度为1×106/ml备用。取试管加入100 μl脾细胞悬液，0.5 μl CD49bFITC，2.5 μl CD3+PE，振荡混匀，避光孵育30 min。加PBS 1.5 ml洗1次，1 500 r/min离心5～10 min，弃上清，加300 μlPBS振荡重悬细胞，上流式细胞仪检测。每组均设同种型对照，Cellquest软件获取数据，Win MDI 2. 9软件分析数据。

结 果

1 A549荷瘤鼠模型的建立 将收集到的A549细胞悬液注入小鼠腋下皮下，经10 d左右，每只小鼠皮下均长成直径为5～20 mm的瘤体(图1)。

图1 A549细胞荷瘤裸鼠

2 肿瘤生长曲线 21 d后，rl-RVG组，NDV组和对照组三组肿瘤体积分别为(804.96±176.74)mm3，(1127.88±274.09)mm3，(1960.92±446.758)mm3(F=26.044，P<0.01)。rl-RVG组和NDV组肿瘤体积明显小于对照组,表明其肿瘤生长缓慢，且rl-RVG组瘤体生长较NDV组慢(图2、图3)，见表1。

3 RT-PCR检测RVG及NDV HN基因表达 取小鼠的皮下瘤体组织，行RT-PCR检测瘤体组织RVG及NDV HN基因的表达，结果显示三组均可在496 bp 出现GAPDH基因条带；rl-RVG组及NDV组在462 bp出现NDV HN基因条带，PBS组无条带(A)；rl-RVG组在175 bp出现RVG基因条带，NDV组及PBS组均无条带(B)(图4)。

4 Western blot检测皮下瘤体组织RVG及NDV蛋白表达 取小鼠的皮下瘤体组织行蛋白质免疫印迹法检测瘤体组织RVG及NDV 的蛋白表达，Western blot结果表明：rl-RVG组有RVG的蛋白条带，NDV组及PBS组无RVG的蛋白条带；rl-RVG组及NDV组有NDV的蛋白条带，PBS组无NDV的蛋白条带(图5)。

图2 三周时各组荷瘤裸鼠瘤体体积

组 别1 d7 d14 d21 drl-RVG组274.67±114.2444.18±111.22657.56±176.74804.96±176.74*NDV组274.08±127.05453.65±164.94958.26±274.091127.88±274.09**PBS组271.78±110.79591.45±244.51483.21±446.751960.92±446.758F值0.0010.8467.75226.044P值0.9990.4580.0090.000

注：rl-RVG组与NDV组及PBS组比较 *P<0.05；NDV组与PBS组比较 **P<0.05

图3 三组瘤体生长曲线

注：1：rl-RVG组GAPDH；2：NDV组GAPDH；3：PBS组GAPDH；4：rl-RVG组；5：NDV组；6：PBS组 M：DL 1 000 DNA Marker；

图4 rl-RVG 感染后组织RVG及NDV HN基因的表达

图5 rl-RVG感染小鼠后瘤体组织RVG及NDV蛋白表达

5 流式细胞术检测rl-RVG转染后脾NK细胞数 结果显示，rl-RVG组、NDV组和对照组三组NK(CD3+CD49b+)细胞数分别为(43.2±5.26)%，(28.8±2.38)%，(18.8±5.9)%(F=31.58，P<0.01)；其中，rl-RVG组和NDV组明显高于对照组(t分别为6.147，3.751，P均<0.05)，且rl-RVG组明显高于NDV组(t=7.203，P<0.05，见图6)。

讨 论

溶瘤治疗是一种集基因治疗、免疫治疗于一体的新的生物治疗方法，作为一种新的癌症治疗方法，具有一定的潜力。近年来，研究发现多种病毒具有溶瘤作用，其中新城疫病毒(NDV) 已经在临床诸多肿瘤中得到广泛应用，并取得了一定的疗效，如乳腺癌[2]、直肠癌[3]等。NDV还可作为免疫疗法运用于神经母细胞瘤[4]，黑色素瘤[5]及其他恶性肿瘤，但关于其对肺癌的研究尚少。

图6 rl-RVG感染后脾NK细胞比例

NDV是无需基因改造的天然的溶瘤病毒，由于其在正常细胞中会引起很强的抗病毒反应，导致短时间内即会被清除，而对肿瘤细胞则能够选择性地感染并在肿瘤细胞中高效复制。复制过程中释放病毒粒子进而感染邻近细胞，邻近细胞相互融合形成细胞合胞体[6]。

NDV对肿瘤的杀伤机制尚不明确，目前多从以下几个方面进行阐述：①NDV对肿瘤细胞能够进行直接并且特异性地杀伤作用；②NDV能够激活宿主细胞及体液免疫应答[7]；③NDV能够刺激机体产生多种细胞因子，增强机体的免疫应答能力[8]。激活的NK细胞可以产生一些细胞因子：如IL- 2、 IFN- γ及TNF-α等，更进一步影响和激活其他免疫细胞的功能，对于肿瘤细胞更具有溶细胞作用[9]。葛金英等[6]成功构建可以建稳定表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒(rL-RVG),稳定表达的狂犬病毒糖蛋白(RVG)，能够增加NDV在细胞之间的扩散且不会增加NDV对禽类和老鼠的毒性及调节受体的结合渗透与结合[10]，使得rl-RVG更有效的作用于肿瘤细胞。

本实验结果显示：RVG及NDV在A549荷瘤鼠皮下瘤中的基因及蛋白表达，说明rl-RVG及NDV成功感染至A549荷瘤鼠内。rl-RVG组及NDV组的肿瘤体积生长速度明显慢于对照组，且肿瘤体积明显小于对照组，说明rl-RVG及NDV对肺腺癌有着明显的抑制作用，且rl-RVG的作用较NDV更加显著。本实验结果说明：rl-RVG及NDV激活了机体的免疫反应， 使NK细胞明显增生，增加机体对肿瘤细胞的杀伤作用，rl-RVG的作用较NDV更加明显。

综上所述，本实验说明重组新城疫病毒rl-RVG对A549荷瘤鼠肿瘤生长有着明显的抑制作用，其可能与rl-RVG自身溶瘤作用及其导致的免疫系统的激活有着密切的关系，为rl-RVG对肺癌的研究指明了方向。