白芍提取物对经前期综合征肝气逆证模型大鼠海马中雌激素β受体及5-羟色胺转运体的影响

王杰琼,孙文君,田 溪,李荟好,孙 亚,王 帅，郜彦鑫

(山东中医药大学1. 药学院、2.中医学院、3.中医基础理论研究所，山东 济南 250355)

经前期综合征(premenstrual syndrome，PMS)系指育龄期女性在月经黄体期，周期性出现的躯体、精神和行为三方面症状的症候群，属情志病症范畴。PMS 肝气逆证是其主要亚型之一，以肝疏泄太过、经前烦躁易怒为主要特征[1],并且“经前出现，经后消失”是该病症典型特点。白芍是促进肝主疏泄，维持正常情志活动的要药。课题组前期研发复方药物白香丹胶囊能有效改善PMS肝气逆证主证烦躁易怒，其中白芍提取物为其君药[2]，但是该药在PMS肝气逆证治疗中的作用机制尚不清晰。

苏巧荣等[3]指出，雌激素受体(estrogen receptor，ER)主要是通过5-羟色胺(serotonin, 5-HT)能系统发挥对情绪的调节作用，中枢5-HT活性降低时，机体对应激刺激的敏感性增加，从而引起抑郁或焦虑等负性情绪[4]。Jantarima等[5]发现，雌二醇(estradiol,E2)可通过上调5-羟色胺转运体(serotonin transporter,SERT) mRNA表达，提高5-HT能系统成分含量及转化率，达到治疗去卵巢大鼠焦虑样情绪的目的。另有研究报道，海马在情绪调节及相关情志疾病发病机制中占有重要地位。因此，本研究选择海马作为研究对象，探讨白芍提取物对PMS肝气逆证模型大鼠ERβ及其介导的5-HT能系统中SERT的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物Wistar大鼠，♀，150只，体质量150～180 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 许可证号：SCXK(京)2007-0001。昼夜颠倒(早9:00关灯，晚9:00开灯)适应性饲养1周。

1.2试剂白芍提取物由青岛海川创新生物天然药物研究中心提供，芍药苷含量35%；盐酸氟西汀胶囊(礼来苏州制药有限公司，国药准字J20130010)；ERβ激动剂diarylpropionitrile(DPN)(ab120166)、ERβ兔多克隆一抗(ab3577)、SERT兔多克隆一抗(ab44520)，均购于Abcam公司；FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)(A0562，上海碧云天生物技术有限公司)；TRIzol总RNA提取试剂盒(SK1322，上海生工公司)；Oligod(T)18 primers (D511，TaKaRa公司)；M-MLV试剂盒(D2639A，TaKaRa公司)。

1.3PMS电刺激大鼠模型制备

1.3.1旷场实验[6]本实验采用阴道涂片法筛选动情周期规律大鼠纳入实验。造模前后，采用50 cm×50 cm×40 cm旷场箱和Xmaze动物行为分析系统，记录大鼠3 min内的活动总路程。

1.3.2动物分组造模及给药 将60只合格大鼠，据旷场总路程和大鼠体质量随机分为5组：正常对照组、PMS肝气逆模型组、氟西汀对照组、ERβ激动剂DPN给药组、白芍提取物给药组。造模方法如下：除正常组外，其他各组大鼠均置于ST-A数字脉冲生物刺激仪。电压2 700～3 300 V，脉宽0.3 s，脉冲间隔为白天5 min，夜晚10 min，持续5 d，造模过程中除正常组、模型组同时给予生理盐水外，其余各组给予相应药物。

各组给药情况如下：正常组及模型组给予生理盐水，白芍提取物组灌胃剂量为40 mg·kg-1·d-1[7]；氟西汀组给药剂量2.67 mg·kg-1·d-1；激动剂组大鼠皮下注射ERβ激动剂DPN(DPN 40 mg溶于1 mL DMSO涡旋震荡溶解后，再加入19 mL 25% DMSO配制成2 g·L-1DPN溶液)，给药剂量2 mg·kg-1·d-1，各组给药时间5 d，每天1次。于末次给药后30 min,采用阴道涂片确定动情周期，其中每组6只大鼠用于海马ERβ和SERT mRNA表达测定，另外6只用于海马组织ERβ和SERT的分布和蛋白表达测定。

1.4海马ERβ和SERTmRNA表达测定各组大鼠断头取脑，继而分离海马组织，立即放入液氮罐中，储存于-70 ℃。采用TRIzol 法提取总RNA。取1 μg总RNA，按1 μg/20 μL反应体系逆转录合成 cDNA，扩增条件: 94 ℃ 150 s,预变性；94 ℃ 30 s，变性；(ERβ：61.6 ℃ 40 s；SERT：61 ℃ 40 s；β-actin:59 ℃ 40 s )复性；72 ℃ 1 min延伸；72 ℃ 7 min，再延伸。之后，取8 μL cDNA产物，以1.2%琼脂糖凝胶电泳(含1%绿如蓝DNAgreen)电泳，电压120 V，时间30 min。以目的基因/β-actin为mRNA相对表达量，进行半定量分析。参照 Gene Bank大鼠基因序列合成ERβ、SERT和β-actin引物，引物序列见Tab 1[8]。

Tab 1 Primer sequence and product size of ERβ and SERT

1.5海马中ERβ和SERT分布状态及蛋白表达各组大鼠用1%戊巴比妥钠(4 mL·kg-1)麻醉,心脏灌流后取全脑，置于4%多聚甲醛中4 ℃封闭。1周后，进行石蜡包埋，切片(厚约5 μm，切片角度5°)。脱蜡、修复后，滴加正常山羊血清封闭工作液50 μL，室温反应30 min。将ERβ和SERT一抗稀释液50 μL于目标切片上进行孵育，避光滴加FITC标记山羊抗兔IgG二抗50 μL，37 ℃孵育30 min，0.01 mol·L-1PBS漂洗3次，每次5 min，随后避光滴加抗荧光衰减封片剂，封片4 ℃保存。利用激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司,LSM510型)观察ERβ和SERT在海马CA1、CA3区的分布及表达。每张切片选取3个视野。使用Image-Pro Plus6.0分析数据，并计算相对荧光强度(relative mean fluorescence intensity, RMFI)，RMFI=积分光密度(IOD)/图片总面积(area)。

1.6数据处理利用统计软件GraphPad Prism 6进行数据处理，组间比较采用One-way ANOVA检验。

2 结果

2.1旷场行为学结果如Fig 1所示，与正常组相比，模型组大鼠自主活动频繁，总路程明显上调(P<0.01)；与模型组相比，白芍提取物干预后，大鼠自主活动趋于正常，总路程明显下调(P<0.05)，与氟西汀和ERβ激动剂组表达一致。

Fig 1 Total distance of rats in each group

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.2大鼠海马SERT、ERβmRNA的表达如Fig 2所示，与正常组相比，大鼠接受期，各组大鼠中枢海马ERβ、SERT mRNA表达均无明显变化(P>0.05)。在非接受期，PMS肝气逆证模型大鼠中枢海马ERβ mRNA表达明显下调，SERT mRNA表达明显上调(P<0.01)；白芍提取物干预后，明显上调ERβ mRNA表达，下调SERT mRNA表达(P<0.05)，并且与氟西汀和ERβ激动剂组表达一致。

2.3大鼠海马CA1、CA3区SERT、ERβ的蛋白表达分布如Fig 3所示，大鼠接受期，与正常组和模型组比较，各组大鼠海马CA1、CA3区锥体细胞多为圆状或点状，排列紧密，差异均有显著性；ERβ、SERT的RMFI差异无显著性(P>0.05)。大鼠非接受期：与正常组比较，模型组大鼠海马CA1、CA3脑区锥体细胞排列不规则，ERβ阳性细胞数和RMFI均明显下降(P<0.01，P<0.05)；SERT阳性细胞数和RMFI均明显升高(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，白芍提取物干预后细胞形态趋于正常，ERβ的RMFI明显升高(P<0.01，P<0.05)，SERT的RMFI明显下降(P<0.01，P<0.05)，并且与氟西汀和ERβ激动剂组表达一致，差异无显著性。

3 讨论

PMS发病机制复杂,目前5-HT作为该病症脑内重要的单胺类神经递质成为研究热点之一，SERT作用于5-HT转运过程，对脑内5-HT水平起到调控作用。动物遗传学的研究结果证实，脑内单胺转运蛋白的功能与行为学表现及情绪状态密切相关。完全丧失SERT功能的基因敲除小鼠表现出5-HT综合征样行为、焦虑抑郁样行为、焦虑抑郁样症状及社交障碍[9]。

诸多研究表明，ER对情绪没有直接调节作用，而是通过5-HT能系统与GABA能系统间接实现的。5-HT能系统中SERT主要功能是将5-HT转运到脑及外周组织的相关受体而发挥作用，因此，SERT功能异常会导致5-HT及其受体相应功能异常，进而出现焦虑、恐惧、抑郁等消极情绪障碍。有研究显示，ERβ基因敲除小鼠易烦躁易怒、焦虑不安[10]。Walf等[11]研究发现，雌激素可作用于海马和杏仁核的细胞内ER，发挥抗焦虑的作用。也有文献报道[12]，雌激素可调节海马CA1区突触发生。另有研究发现[13]，雌激素可引起去卵巢恒河猴SERT mRNA在中缝背核的表达明显下降，SERT mRNA阳性细胞的数量也明显减少。因此，说明雌激素及其受体能够介导5-HT能系统功能。

本研究采用改进的情志刺激为主的多因素造模法，主要通过电刺激复制PMS肝气逆证大鼠模型，将非接受期大鼠置入可调式电刺激笼内，在减少电击造成的躯体伤害的同时加强心理性应激[14]，利于模型的成功复制。旷场实验可用来评判动物焦虑和抑郁状态[15]。本研究结果显示，大鼠在非接受期，模型组活动总路程明显升高，说明PMS肝气逆证模型大鼠表现出焦虑样行为。给予白芍提取物后，活动总路程明显较少，说明白芍提取物可明显改善PMS肝气逆证引起的负性情绪。

基因检测结果显示，大鼠动情接受期，各类指标并无明显变化。在非接受期，PMS肝气逆证模型大鼠海马ERβ mRNA表达明显降低，SERT mRNA明显上调；海马CA1、CA3区锥体细胞排列杂乱，ERβ 阳性细胞数目减少，RMFI明显下降，SERT阳性细胞数目增多，RMFI明显升高，给予白芍提取物后的细胞形态趋于正常。以上研究结果与本研究所得模型大鼠海马区ERβ mRNA和蛋白表达均明显下降，SERT mRNA和蛋白表达升高均一致。提示白芍提取物可能具有雌激素样作用，或者能够通过改善中枢海马ERβ的功能，继而纠正5-HT能系统中SERT的功能，最终起到调整PMS肝气逆证烦躁易怒等主要症状的作用。

Fig 2 Expression of ER and SERT mRNA in hippocampus of rats at both estrous receptive(A) and non-receptive

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel;1：Control;2:Model;3:Paeonifiorin extract;4:Fluoxetine;5:ERβ agonist

综上所述，采用情志刺激为主多因素造模法可以成功制备PMS肝气逆证大鼠模型，模拟PMS主要特征“经前出现，经后消失”。通过该模型的研究，初步证明PMS肝气逆证的发病机制可能与大鼠海马ERβ、SERT的蛋白表达和mRNA的改变有关。白芍提取物有可能发挥雌激素样作用，通过改善海马区ERβ 和SERT的表达，起到调节PMS肝气逆证负性情绪的作用。但是白芍提取物雌激素样作用及其具体机制尚需进一步探讨。

(本实验是在山东中医药大学中医基础理论研究所完成，感谢该研究所及情志病证创新研究团队所有同仁的支持和帮助)