过量铜胁迫对柑橘影响的研究进展（3）

郑重禄

（福建省泉州市洛江区农业水务局 泉州 362011）

编者按：随着含铜化肥和农药，污水灌溉、污泥和畜禽粪便的长期大量使用及工业“三废”排放量的增多，增加了土壤中的铜（Cu）含量，植物铜中毒的现象越来越普遍。本文主要综述了柑橘对铜毒害的反应、过量铜对柑橘细胞超微结构、酶活性、光合作用和铜过量与其他元素的吸收影响等，从而为更深入的研究柑橘铜中毒的机理，合理调控果园土壤铜的生物效应，防止铜的污染，指导平衡施肥提供一定的参考。由于文字较多，分期连载。

3 铜毒害对柑橘生理机能的影响

3.1 铜毒害对柑橘体内酶活性的影响

过量铜的摄入会导致活性氧（ROS）及其他过氧化物自由基增加，影响植物体内保护酶类、氮代谢酶类、光合酶类等酶的活性，尤其是碳水化合物代谢和氮代谢酶类的活性。高铜胁迫抑制超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、脱氢酶、蔗糖酶、NADHCytC 还原酶等酶的活性，致使酶系统的平衡打破，植物体内的自由基含量上升[68]。高铜胁迫下，超氧阴离子（O-2）含量表现出先降低后增加的趋势，随着处理时间的增加其含量有所增加；过氧化氢（H2O2）的含量则随着铜处理浓度的增加而增加。

高铜胁迫常引起ROS 平衡系统失调，这与植物螯合肽的产生和谷胱甘肽（GSH）减少有一定关系。GSH 的降低使植物细胞自由基产生和清除的平衡遭到破坏，细胞膜质过氧化加剧。过量铜影响酶活性的机理，一种可能是由于铜的作用使作为酶的辅助因子的铜离子（Cu2+）的吸收和利用受阻；另一种可能是铜与酶蛋白的某些结合形成螯合物，使酶的结构与构型发生变化而影响酶的活性。轻微铜毒害使植物体内的酶类活动不正常加强，这也是植株对铜毒害的一种适应发应；而高浓度的铜施加于土壤中时，使植株的呼吸、代谢等一系列活动均受到破坏，从而影响整体植株的生长。HipplerFR等[67]研究表明，24μmol·L-1CuSO4·5HO2对柑橘嫁接小苗胁迫处理90d后，H2O2含量、Cu/Zn-SODⅢ活性显著升高，抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）活性升高，SOD酶活性在胁迫过程中呈先上升后下降的趋势。

邱栋梁等[69]研究发现，当低浓度Cu2+处理时（＜1mg·L-1），柑橘叶片SOD、POD、谷胱甘肽还原酶（GR）和APX 等抗氧化酶活性增加从而提高自由基清除能力，使ROS维持在一个较低的水平，可有效避免铜的毒害作用。但是，当Cu2+浓度＞5μmol·L-1时则抑制其活性，导致ROS 的大量积累，超出细胞自身的抵御能力，氧化胁迫和脂质过氧化程度加剧，最终导致植株生长受到抑制。5～40μmol·L-1Cu2+处理下，柑橘叶片SOD、CAT、多酚氧化酶（PPO）活性随着Cu2+浓度的增加呈先增后降，而POD则一直上升，SOD和CAT活性在0.1μmol·L-1Cu2+处理时达最大，而PPO活性则在5μmol· L-1Cu2+处理时达最大；POD活性的增加是由于Cu2+进入柑橘体后，产生了一些过氧化物，造成POD 底物浓度增加，致使POD活性渐增。由此可见，低浓度铜使柑橘的保护酶发生了应激性的提高以清除、分解有毒害作用的O-2，从而起到保护作用，但这种保护作用是有一定限度的，超过这个限度保护酶活性就会降低，柑橘受到的毒害加剧。而高浓度Cu2+处理时，Cu2+与酶的作用基（特别是巯基）结合后，Cu2+会使之发生沉淀、络合等反应，使酶类蛋白质发生变性，酶活性降低，最终导致失活，柑橘叶片膜脂过氧化加剧。

另外，铜通过活化硝酸还原酶来参与植物体内氮代谢，并对植株体内的氨基酸组成有一定的影响。过量铜会降低氮同化作用相关的硝酸还原酶活性，植株氮素营养水平、游离氨基酸含量显著下降，植物体内的氮代谢受到严重干扰[66]。可溶性蛋白质大多是参与各种代谢的酶类，铜胁迫下，植物体内的可溶性蛋白含量往往发生明显的变化。过量的铜会促进植物体内自由基和活性氧等有害物质产生，进而对相关蛋白、DNA和其它生物分子产生损伤。邱栋梁等[69]研究发现，柑橘叶片在0.1、5μmol·L-1Cu2+处理下，可溶性蛋白质与对照相比没有明显的变化，而20、40μmol·L-1Cu2+处理时，柑橘体内一些原来正常的蛋白质合成受阻，同时诱导一些新蛋白的产生。由此可见，当Cu2+浓度升高到一定程度时，Cu2+大量进入柑橘体内，不仅与核酸、蛋白质和酶等大分子物质结合，而且还可取代某些酶蛋白行使其功能时所必需的特定元素，使其变性或活性降低，造成生理功能紊乱。

3.2 铜毒害对柑橘细胞膜系统的影响

细胞膜系统是植物遭受伤害的敏感部位。过量铜胁迫首先对植物细胞膜以及多种细胞器（包括叶绿体和内质网等）的膜系统产生伤害，直接影响细胞质膜的选择透性、组成、结构和生理生化特性。离子泄漏和水分代谢失调是铜胁迫破坏质膜的结果，而膜脂过氧化和巯基化合物含量的下降是质膜透性增加的直接原因[70]。

活性氧（ROS）是光合、呼吸、固氮等代谢过程中不可避免的副产物。单价态铜与氧结合易产生超氧阴离子（O-2），而在中性水相环境中，O-2可转化为过氧化氢（H2O2），H2O2又可以在铜的催化下生成羟基自由基（-OH）等ROS[71]。ROS 的过量积累，会导致生物膜脂质过氧化，蛋白质交联失活、DNA 链断裂以及光合成受阻，甚至引发死亡。铜毒害会造成细胞内ROS增加，因此铜的毒害也被看作是由ROS 调节的氧化胁迫。另外，过量Cu2+可与膜蛋白的巯基或磷脂分子层的磷脂类物质反应而损伤质膜，加重膜脂的过氧化作用，从而使膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量增加[72]，改变膜蛋白的磷脂结构，致使膜系统遭受损坏，流动性减小，膜透性增大，强度下降，影响细胞器的结构功能，同时使胞内物质外渗而亏缺，细胞发生死亡[71]。

邱栋梁等[69]研究发现，低浓度的Cu2+（≤0.1μmol·L-1）处理脐橙52苗木时，叶片MDA含量和K+、Cu2+的渗漏值均与对照差异不显著；但当Cu2+处理浓度为5μmol·L-1时，MDA含量、K+、Cu2+的渗漏值均显著提高，且随着Cu2+浓度的增加而提高；MDA含量与K+、大分子渗漏值呈显著的正相关。当Cu2+浓度在5～40μmol·L-1范围内时，随着Cu2+浓度的增加，柑橘叶片细胞膜受到的伤害也越严重，选择透性大大降低，MDA的大量积累，导致细胞膜透性显著增加，造成细胞膜内酶及其原代谢作用区域受到损伤，使色素含量降低，生长减慢。由此可见，随着高铜胁迫的加剧，细胞膜的透性由于过量铜的存在而发生改变，调节K+、大分子外渗的能力逐渐减弱，甚至最后渐渐消失。在高铜胁迫下，柑橘叶片细胞质膜产生过氧化，破坏了膜脂的完整性，使细胞膜强度下降，导致Cu2+渗入细胞和MDA含量增多，离子和大分子物质大量外渗，膜透性增大。

3.3 铜毒害对柑橘光合作用的影响

铜参与植物叶绿素和其他色素的合成,铜是质体蓝素的重要组成成分，质体蓝素是光系统Ⅱ和光系统Ⅰ电子传递过程的重要中间体。植物的光合作用功能对铜毒害很敏感。过量的铜能修饰加工色素分子和降低色素合成酶的活性，抑制光合作用暗反应中关键酶的活性，如对光合作用的抑制与其抑制1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPcase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPase）的活性有关，明显降低叶片光合色素含量，并且损伤光合细胞器，破坏类囊体结构，抑制光合链中的电子传递，尤其是对光合作用系统Ⅱ（PSⅡ），主要是抑制初级电子供体和受体产量[73]。高于1μmol·L-1时Cu2+即可成为光合链中的电子传递的抑制因子[74]。过量铜胁迫还会抑制和防碍叶绿素进入光合系统，使叶片发黄，叶绿素a、b 含量显著下降，叶绿素荧光下降，光合作用受到抑制[75],从而降低植物光合作用效率。由此可见，过量的铜对植物光合作用的影响是通过影响光合过程中的电子传递、破坏叶绿体和叶绿素等光合系统的完整性而实现的。

Ilyas等[76]用0.1%CuSO4·7HO2喷施柑橘树冠，叶片净光合作用、叶绿素含量显著提高，超过0.1%时净光合作用下降。张国军等[77]研究表明，外源铜处理下，脐橙幼苗叶绿素的含量随着Cu2+浓度的增加先增后降。低浓度的Cu2（+≤0.1μmol·L-1）有利于脐橙幼苗光合色素的形成，叶绿素的含量比对照显著增加。而高浓度的Cu2（+5～40μmol·L-1）使脐橙幼苗叶绿素含量下降，类胡萝卜素的含量也随Cu2+浓度增加不断下降。这和Cu2+与叶绿体色素形成配位化合物有关。由此可见，Cu2+在低浓度时会促使叶绿素含量增加，而高浓度时抑制叶绿素合成。这可能是由于Cu2+在低浓度时，少量的Cu2+弥补了柑橘体内叶绿体质体蓝素（蓝蛋白）的所需[78]。而高浓度的铜胁迫，抑制叶绿素酸脂还原酶的活性，影响氨基酮戊酸的合成，导致叶绿素合成受阻，使叶绿体酶活性失调，还破坏类囊体上的色素蛋白复合体机构[79]，促进叶绿素分解。

有研究认为,植物受到铜过量胁迫后，由于Cu2+的局部积累较多，与叶绿体中蛋白质-SH 结合或取代其中Fe2+、Zn2+、Mg2+致使叶绿素蛋白中心离子组成发生变化而失活，叶绿素酶活性失调，从而影响叶绿素的合成,叶绿素分解，必然导致柑橘发生褪绿现象,影响光合作用[80]。

张国军等[77]研究发现，低浓度的Cu2（+≤0.1μmol·L-1）处理使脐橙幼苗叶绿体光还原活性比对照有所增加；还增加叶片蒸腾速率（Tr）和气孔导度（Gs），促进叶片气孔开放，有利于气体交换，因而增加叶片的光合速率，促进生长；而高浓度的Cu2（+5～40μmol·L-1）处理使脐橙幼苗叶绿体光还原活性受到抑制，且Cu2+浓度越高，下降和抑制幅度越大，光补偿点和呼吸速率提高；造成光合效率降低，净光合速率（Pn）、光饱和点下降；5μmol·L-1和20μmol·L-1Cu2+处理使叶片Tr和Gs下降。由此可见，高铜胁迫使叶片叶绿体光还原活性受到抑制，严重影响了PSⅡ的电子传递；叶片Pn下降，存在气孔因素和非气孔因素，Pn与Tr 同步受到抑制，导致脐橙幼苗叶片Tr明显下降；从而抑制了整个光合作用的进行。

叶绿体是植物细胞最需氧（O2）的分区，叶绿体类囊体膜富含不饱和的脂肪酸，因而对活性氧（ROS）诱发的膜脂过氧化特别敏感。过量铜对希尔反应活性的抑制作用是由于光合膜中类脂的过氧化和PSⅡ（光合系统Ⅱ）的紊乱，影响光抑制和光修复之间的平衡，导致受光照叶片的光系统Ⅱ活跃中心稳定的电子浓度下降和非周期的光合磷酸化作用的破坏[81]。由此可见，低浓度Cu2+处理能促进脐橙幼苗的光合作用，而高浓度有明显的抑制作用。这可能是柑橘吸收Fe2+和Cu2+之间存在竞争，导致Fe2+短缺引起叶绿素合成受阻，从而提高PSⅡ对光的敏感性，阻碍光合作用中CO2的固定有关。杨丹慧[82]则认为，高浓度Cu2+会大大的减弱植物的光合效率，主要是由于进入叶绿体中的铜沉积到了类囊体上，破坏了叶绿体酶系统结构，这可能就是柑橘叶片变黄脱落的主要原因。

张国军等[77]研究认为，高浓度Cu2+处理使脐橙幼苗叶绿素含量降低。这可能是由于过氧化氢酶（CAT）活性下降，导致过氧化氢（H2O2）的积累而促进叶绿素的降解。高铜处理使超氧化物歧化酶（SOD）活性下降、丙二醛（MDA）含量上升，导致过氧化产物积累，膜透性增加[69]；高铜处理还使过氧化物酶（POD）活性上升，POD的上升导致叶绿素含量下降[51]。

另外，线粒体是细胞呼吸作用的主要场所，含有大量的酶。张国军[51]研究发现，高浓度的Cu2（+≥20μmol·L-1）处理时，柑橘细胞中线粒体结构会受到破坏，线粒体变形，线粒体膜局部破裂，线粒体膜系统受到破坏，线粒体嵴数量明显减少甚至解体，导致酶分子附着的表面减少，细胞呼吸作用减弱，糖的有氧代谢受阻，以ATP 形式提供的能量减少，进而影响柑橘的各种正常生理代谢。

3.4 铜毒害与其他元素的关系

柑橘在铜过量胁迫下，根系和枝叶锌（Zn）、铁（Fe）、锰（Mn）的吸收量显著下降，其中Fe的吸收下降最为显著[83]。过量的铜能与矿质元素竞争植物吸收位点或转运载体[84]，抑制其它矿质元素含量，导致除铜以外的元素匮乏，可能是因为铜作为转运蛋白的其中一种底物，而影响其它元素的结合和转运。同时，当铜过量时细胞膜透性改变，矿质元素运输过程受到影响，导致矿质元素的缺乏。

黎耿碧等[31]研究发现，过量的铜明显抑制柑橘小苗对氮（N）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、铁（Fe）等常量和微量元素的吸收，且与这些元素的吸收均达极显著负相关；当铜离子（Cu2+）浓度大于0.1μmol·L-1就明显干扰养分元素的吸收和转移；Cu2+浓度在0.1～5.0μmol·L-1范围内，柑橘根系和叶对P、K、Ca、Mg等的吸收量都下降60%以上，但其转移率无明显变化；随着Cu2+浓度的增加，铜的转移率和柑橘的生长量下降，P、K、Ca、Mg 在柑橘体内的转移率保持不变，而Fe、Mn、Zn 在柑橘体内的转移率却表现为上升。这说明，不同养分元素在柑橘体内吸收转移特性不同。

过量的铜通过降低N 的吸收来干扰氮代谢[85]。有试验表明，铜过量处理下，柑橘小苗根部N-NO3、总氮、硼（B）含量下降，叶片硫（S）含量也显著下降[29]。过量的铜能显著影响柑橘对P的吸收，使柑橘体内P的含量减少。反之，多施磷肥会阻碍柑橘植株对铜的吸收，有助于降低铜的毒性。利用50μmol·L-1Cu2+处理甜橙嫁接苗，叶片铜含量在充足的P 供应条件下比缺P时减少了26%，细胞结构的受害程度更轻[50]。GrahamJH等[59]研究表明，过量铜抑制柑橘根系对P的吸收，主要是因为外生菌根受到抑制，对P的吸收固定减少；出苗两个月的柑橘小苗，在低P土壤中，叶中含P 量与不同土壤浸提铜浓度的对数呈显著负相关。若土壤中已施入磷肥，这种关系则发生变化[86]。郑苍松[63]研究发现，南丰蜜橘园土壤有效铜与叶片K含量呈显著负相关。轻微的铜中毒，柑橘的K素就会受到严重影响而导致其品质下降[31]。

Ca 与铜之间存在拮抗作用。可通过施加CaCO3提高土壤pH值，降低铜的生物有效性而缓解铜中毒[87]。高铜土壤中交换态铜比例因Ca含量的增加，而明显降低，铜的迁移量也随之减少。有研究表明，在含铜量200mg·kg-1的土壤中，土壤表层有效铜的含量随着CaCO3浓度增加而减少，可显著降低根中铜的浓度，减轻铜对柑橘小苗的毒害，同时柑橘小苗枝叶、根系干质量增加[65]。高铜处理中Ca 的施入能增加叶绿素含量，可能是由于施Ca以后，植株对铜的吸收量减少，与Ca 具有稳定细胞膜的作用有关。由此可见，Ca 对缓解铜中毒具有一定的作用。施加CaCO3能够缓解土壤铜毒害对粗皮柠檬植株生物量的抑制，但是不能缓解对印度酸橘生物量的抑制[65]。这可能与柑橘不同品种的生理特性差异有关。

黎耿碧等[31]研究发现，随营养液中Cu2+浓度的增加，明显抑制柑橘小苗对Ca2+、Mg2+等元素的吸收；外界的Cu2+浓度的升高，柑橘茎、叶中的K、Ca、Mg、Zn 等的含量降低。在铜含量高的土壤上，pH值及Ca、Mg、Fe、Zn 等的含量显著降低，而由于某些土壤含有石灰性物质，且pH值及Ca、Mg、Fe、Zn 等含量也较高，因而发生铜中毒的现象较少见[59]。在田间环境下，采用撒施2kg/株石灰能有效中和耕层土壤酸度，增加土壤pH值，诱导土壤对活性铜的吸附和固定作用，且降低温州蜜柑果实可滴定酸，增加固酸比[40]。当土壤pH值为5.9～6.5时，随外源铜浓度增加，植株中Ca 的含量减少[88]。

柑橘对金属离子如：Fe2+、Mn2+、Mg2+和Zn2+的摄取容易被具有相同价位的Cu2+抑制。有研究表明，当植物体Fe和Zn缺乏时，Fe通道蛋白（ITRI）和Zn通道蛋白（ZIP）以及相关诱导转运蛋白为植物吸收Cu 提供了便利[89]。Fe 是多种酶的辅基，并参与叶绿素的合成。Fe和Cu 之间具有拮抗作用。铜能氧化Fe2+为Fe3+，过量的铜会阻碍柑橘对Fe2+的吸收和转运[43-44]。Fe 的缺乏有利于枳根系对Cu的吸收及向上转运[90]。外源铜的增加对柑橘吸收Fe 的影响尤为严重，使柑橘叶片黄化并使叶片中含Fe 量降低的现象早在1952年就已报道过[91]。

过量铜胁迫造成柑橘Mg 含量下降的原因是Cu2+可取代叶绿素中的Mg2+，这一现象导致了柑橘叶绿素含量下降，光合作用受阻[92]。AlvaAK等[29]研究发现，随着营养液中Cu2+浓度的增加，柑橘根系对Fe、Zn和Mn的吸收减少。过量铜降低了Fe、Zn和Mn的吸收，根部表现尤为明显，这也可以解释根受铜毒害尤为严重的现象。铜在酸性土壤中的竞争吸附能力强于Zn。土壤中铜的存在严重的抑制了Zn 的吸附和运转，树体内铜含量的增加不利于Zn和Mn 由根向叶内运转[93]过量铜胁迫造成柑橘Fe、Zn 等含量的减少可能有两个原因：一是因为根部受损，细胞结构损坏，细胞膜渗透性提高，吸收功能减弱，二是因为Fe、Zn与Cu 的拮抗作用，究竟这两者谁的影响大，尚有待进一步研究。因此，对于柑橘来说，铜和其它养分元素的平衡关系，可能比铜本身的绝对量更重要。

4 结语与展望

目前对柑橘铜毒害的研究主要集中在细胞超微结构、酶活性、光合作用和铜过量与其他元素的吸收等方面，但这些研究的深度和广度还有待进一步加强。尤其在生理生化方面还有待进一步的深入研究。如在分子水平上，对柑橘过量铜胁迫下基因表达谱的动态变化，柑橘对铜毒害的耐性及其遗传调控，柑橘细胞如何感应过量铜信号的刺激，过量铜胁迫如何影响柑橘激素的合成和平衡等还未见有报道。对柑橘铜毒害的机理和过量铜积累性、耐性的机理仍处于探讨阶段，需进一步的研究与证实。

随着分子生物学、高通量基因组学、转录组学和蛋白质组学等研究方法的应用，在今后的研究中应集中从分子和蛋白水平上，积极开展柑橘过量铜的吸收、储存、迁移和循环等机理的研究。从基因水平上揭示柑橘铜毒害的分子机理和耐铜胁迫机制。另外，从柑橘栽培措施探讨如何减轻铜毒害的措施。从而为今后进行铜对柑橘污染的预测、评价和防治提供理论依据。