肾移植术前免疫致敏评估的研究进展

王 婷，赵帅林，杨关印，高宝山，徐志强

(1.吉林大学第一医院 泌尿外二科，吉林 长春130021；2.通辽市医院 泌尿外科，内蒙古 通辽028000)

肾移植是终末期肾功衰竭患者的最佳治疗方法。由于强效免疫抑制剂的应用，移植术后短期急性排斥反应明显减少，然而移植肾长期存活率仍有待提高。人类白细胞抗原(HLA)的免疫致敏被认为是影响移植肾存活的主要原因。因此充分了解实验室如何评估HLA的致敏作用，对于判断器官移植潜在受者是否可接受供者的器官、围手术期决策制定、预测手术风险及远期影响至关重要。本文以HLA抗原和抗体为中心，阐述移植术前HLA实验室检测在免疫学风险评估中的作用、检测HLA致敏的方法、结果解读及其局限性，为准确评估肾移植免疫风险、提高移植物远期存活提供依据。

1 致敏的定义

器官移植前的评估中，致敏是在潜在受者中检测是否存在对一种或多种HLA抗原具有反应性的抗体。由于其在移植免疫中的重要性，HLA基因及相应的抗原得到了广泛的研究，且越来越多的等位基因被发现[1]。受早期检测技术的限制，仅HLA A、B和DR抗原及相应抗体得到了较深入的研究。然而通过研究已逐渐认识到所有HLA基因的差异均可能导致同种异体识别及免疫损伤[2]。

抗原应答的产生需要向T细胞和B细胞提呈抗原，并产生促进T细胞及B细胞活化的信号。因此致敏的产生需要两个关键因素—抗原的暴露及能够对抗原做出反应的免疫系统。典型的致敏过程包括妊娠、输血及既往器官移植。在这些过程中均存在非自身组织的引入，且非自身抗原可能提呈给T细胞和B细胞[3]。如果宿主识别了与自身HLA抗原不同的抗原，并且除T细胞介导的炎症途径之外，B细胞途径也可被激活，就可在外周血中产生和检测出抗HLA抗体。此外记忆性B细胞途径可被激活，如循环抗体减弱，记忆性抗体应答仍可在再刺激时快速产生。如果循环HLA抗体对移植物表达的抗原具有特异性且具有足够高的滴度，则免疫系统可完全激活并破坏移植物内皮，此经典过程称为超急性排斥。介导损伤的抗体常常会缓慢出现，随着检测技术的进步，研究人员逐渐认识到，可检测出的抗体直接导致的临床后果并非是绝对的，而且在检测中可能得到非特异性结果[4]。此时需要临床医生及HLA实验室共同解读，而不是接受简单的阳性或阴性结果。

2 HLA实验室检测和移植前风险评估

在临床HLA实验室中检测免疫致敏的平台主要有HLA分型，HLA抗体检测和交叉匹配。肾移植候补名单面临的主要问题是为移植受者找到HLA匹配的供体，这就需要了解潜在受体中HLA抗体的特异性和强度以及潜在供体中HLA抗原出现的频率。目前移植前需要着重了解的是受者体内是否存在供体特异性抗体(donor specific antibody，DSA)[5,6]，从而避免高风险移植或移植后加强免疫抑制治疗以降低移植物排斥的风险。器官移植后记忆性同种异体免疫的形成或新生HLA抗体意味着移植物发生急性和慢性抗体介导损伤的风险更高。

3 HLA分型

受检测试剂及检测方法的限制，传统的肾移植HLA分型主要包括HLA-A、HLA-B及HLA-DR。传统检测方法是将受体细胞与已知抗HLA抗体血清共孵育，通过观察细胞死亡来确定分型。这种检测方法已被基于反向序列特异性寡核苷酸引物(R-SSO)或序列特异性引物(SSP)的聚合酶链反应(PCR)技术所取代。此检测中，由于使用的是给定的HLA基因相关引物，因此受者DNA通过PCR仅以给定的类型发生扩增，通过分析哪种引物导致扩增即可鉴定HLA的基因型。R-SSO和SSP技术可在数小时内提供结果，且可以检测任何人的HLA蛋白分型，即 A、B、Cw、DR、DRw、DQ、DP。以往0/6错配被认为是最佳匹配，而6/6错配为最差匹配(由HLA-A、B、DR各2个抗原之间的差异所定义)。供受者之间的错配程度对移植物长期存活有显著影响[7,8]。研究发现，包括HLA-Cw、HLA-DP和HLA-DQ在内的所有HLA蛋白都是可导致抗体形成的抗原性靶标，并对移植物存活产生影响[9-11]。目前已知的抗HLA-II类抗体大多数为抗HLA-DQ抗体[12]。

从血清学分型到基于PCR分子分型的转变使得HLA分型更为精细和准确。由于血清学方法依赖于完整的抗原—抗体反应，因此并不能轻易区分那些编码蛋白质大体相同但免疫原性具有微小差异的等位基因。而特定的分子引物能够对等位基因变异归类分型，可检测到仅有单个氨基酸不同的等位基因变异，因此目前标准化的HLA分型已被广泛应用。“*”用于表示该结果通过分子学方法获得，在第一个区域中所报告的基因位点，与第二个区域中与之相关的等位基因由“:”加以分隔，例如HLA-A * 02：01格式，该分子分型所对应的血清学结果为HLA-A2。分子分型目前不仅可以区分等位基因，还可以区分特定的蛋白质、DNA变异和非编码区域内的变化。因此，一个“完整”的分型格式可以具有多达四个标识符，例如 HLA-A * 03：01：01：02 N[13]。因为机体可能会针对具有微小的但具有免疫原性的等位基因差异(例如HLA A * 02:01与A * 02:03)的相同抗原组(例如HLA-A2)的蛋白质而产生抗体，通常在实体器官移植中仅考虑前两个区域中的差异(代表抗原的蛋白质整体结构中的氨基酸差异)。

HLA分型的命名法进一步发展以更好地描述II类HLA-DP和DQ蛋白的结构和作用。HLA II类蛋白的结构具有更复杂的抗原性潜力。任何HLA分子(Ⅰ类和Ⅱ类)的关键抗原区域是肽结合凹槽(围绕β折叠的两个α螺旋)，在此区域发生的抗原提呈是HLA分子的天然生物学功能。在HLA I类分子中，凹槽完全位于单个α蛋白链中，所有表位的多态性都位于其中，β链或恒定链在个体之间是高度保守和单态的，因此不会产生抗体反应。相反，HLA II类分子的α和β肽链均具有抗原潜力，并可能具有独立的免疫原性。进一步认识移植受体可能产生针对α链表位、β链表位及α链与β链交界面的抗体，需要HLA分型完整性和抗体检测报告的发展[14,15]。HLA II类抗原传统上仅根据β链命名，但如果要充分描述供体和受体之间潜在的免疫原性，则须清楚地区分及鉴定α等位基因，并将不同的α-β组合抗原识别为潜在的免疫靶标[16]。而针对DQ抗原形成的抗体大约四分之一以DQA和DQB混合的形式存在，这种形式很难被单抗体包被的微球检测所识别[16]。

4 抗体的检测及鉴定

通过输血、妊娠及既往移植而接触到非自身HLA抗原可导致抗HLA抗体的产生[17,18]。移植前准确鉴别这些抗体有助于器官移植受者避免表达供体抗原的移植物的免疫刺激。临床上检测到的器官移植受体预存的相关抗体是在供体抗原刺激下产生的，此类抗体会导致急性或慢性移植物排斥反应。

早期HLA抗体的检测是利用补体依赖的细胞毒(CDC)的方法。如果受体预先生成DSA，受体血清与供体细胞共同培养后将导致抗原-抗体复合物的形成。向培养物中加入外源性补体，形成的抗原-抗体复合物将激活补体途径，随后可出现细胞毒性作用及细胞死亡。供体死亡淋巴细胞比例>20%通常表示受体血清中存在DSA。此方法为定性诊断，结果受操作流程影响较大，同时细胞死亡也可能受培养条件及样品处理的影响，因此精准度具有一定局限性。而且同时须进行阳性(具有已知HLA抗体的血清)和阴性(已知缺乏特定HLA抗体的血清)对照。要激活补体途径则需要高滴度的DSA，如抗体滴度不足以导致细胞死亡，则检测结果可能是假阴性，但同等滴度的抗体含量仍可能导致同种异体移植物损伤。此检测中可添加抗人球蛋白(AHG)来改善CDC方法的灵敏度。AHG可促进补体活化并因此在DSA存在的条件下发生更强的阳性反应，将供体淋巴细胞分为T细胞或B细胞共同培养，进而分别鉴定HLA Ⅰ类和/或Ⅱ类抗体。

CDC方法可通过检测群体反应抗体(PRA)来估测移植受者血清对特定人群HLA抗原的反应概率。用于检测的淋巴细胞组合通常来自当地人群(通常50-60人)，此方法可粗略估算移植受者对人群中HLA抗原具有反应性的百分比(死亡淋巴细胞的百分比)，从而估算对于该群体而言免疫学上不能进行移植的供体的百分比。应用此检测方法也可发现滴度最强的HLA抗体及最常见的阳性HLA抗体，但该方法可能因淋巴细胞组合的不同出现检测偏差，譬如所选择的淋巴细胞组合中不包括罕见的HLA抗原，或组合中包含过多重复抗原，检测结果将会出现较大的差异。有研究发现，部分非HLA抗体如内皮细胞抗体和血管紧张素抗体均可影响肾移植预后，此类抗体对移植物的影响越来越受到关注[19,20]，但这类抗体并不能被PRA检测所发现。

在血清学HLA分型方法被基于分子DNA检测平台取代的同时，抗HLA抗体的血清学鉴定也逐渐被更灵敏和特异的基于流式细胞术的各类固相检测方法所取代。这些固相检测法使用包被HLA抗原的微球[21]。如果检测到抗原，可以使用单抗原微球(SAB)进一步精确的鉴定其特异性，其原理为每个单抗原微球表面包被一种来自患者细胞系的Ⅰ类或Ⅱ类抗原，因此除了罕见表型以外，所有常见的HLA抗原都可以用此方法检测[22]。将包被抗原的微球与待检测抗体共孵育，并加入与荧光染料相结合的抗人球蛋白抗体，如果血清内抗体与HLA抗原上的表位相结合，则可通过流式细胞术检测出荧光染料包被的抗球蛋白抗体-微球复合物。由于此检测方法灵敏度较高，因此血清内可能导致移植物损伤的低浓度抗体也可检测出来[22,23]。

5 交叉匹配

移植受体对目标供体反应性的最后一种评估方法是交叉匹配。传统的基于细胞反应的交叉配型使用上文提及的相同的CDC方法。但与前者的关键区别在于，此检测所有供体的HLA抗原都将被用到，无论其在人群中的总体普遍性如何。但此检测仍然存在敏感性及特异性问题(例如存在非HLA抗体、自身抗体或低浓度的DSA)，因此正确解读检测结果对于有效规避高风险移植但不会因误判而舍弃适合移植的器官来说至关重要。

流式细胞技术的发展及抗人球蛋白的应用，改善了交叉配型检测的灵敏度[24]，与基于流式细胞术的固相抗体检测相似，当受者血清与供体细胞共同培养时，可通过荧光标记的抗人IgG检测受者血清中低滴度的DSA。研究发现通过此方法检测出的更低滴度的抗体，仍与器官移植后移植物短期及长期的排斥反应有关[25]，而此滴度下的抗体应用基于补体反应的交叉配型检测则是阴性的。

交叉配型应包括T淋巴细胞(表达Ⅰ类HLA抗原)和B淋巴细胞(表达Ⅰ类和Ⅱ类HLA抗原)，以及自身交叉配型用以控制与自身抗体相关的假阳性结果。为了确保阳性交叉配型结果具有免疫学相关性，所有交叉配型检测最好通过SAB完成[26,27]。相反，如果T细胞及B细胞交叉匹配均为阳性，而自身交叉匹配结果也为阳性，但检测不到DSA，则可能是由于免疫学上无关的自身抗体所导致的，不应排除移植的可能性。

6 HLA实验室检测在移植前临床实践和决策中所起的作用

6.1等待名单或移植前候选人由于个体内的循环抗体含量可随着时间的推移增多或减少，因此在等待移植的同时应定期检测HLA抗体以确保最准确反映个体的免疫潜能。再次免疫暴露时可能发生剧烈的抗体反应，因此应在致敏事件4-6周后重复检测HLA抗体。然后可将抗体特异性列表与已知群体内的供体HLA频率进行比较[28,29]，以生成计算的PRA(cPRA)。cPRA的准确性取决于组织配型库中多个位点的供体分型的完整性，HLA分型数据越完整，得到的cPRA值越准确[30]。并可利用这些cPRA值来管理等待移植名单上高度致敏的潜在受者从而对其进行优先排序，为患者提供移植机会的参考[31,32]。然而cPRA值并不能单独用于量化排斥反应的免疫风险。

对于高致敏的等待患者需要改变供体器官分配理念，以确保他们在等待名单中不会处于劣势地位[33]。当移植风险较低时，可预先尝试去抗体策略。此外，部分移植中心尝试开展了肾脏配对交换方案，其中不适合其预期受者的活体供体可能是另一患者的合适供体，而这位患者的原始供体又可能依次与另一受者相匹配。该策略增加了移植成功的机率并有效缩短了等待移植的时间[34,35]。 对于cPRA值非常高(>95%)的个体也可通过脱敏方案来提高其获得移植的机会[36]。通过血浆置换或免疫吸附去除预存的抗HLA抗体、使用静脉内免疫球蛋白调节抗体产生、使用利妥昔单抗或硼替佐米靶向清除B细胞以减少抗体产生及应用依库丽单抗阻断补体激活等方案单独应用或联合应用均取得了不同程度的疗效[37-39]。尽管抗体脱敏方案需密集治疗，但与持续血液透析相比，其成本效益比仍具有优势[40,41]，已经使美国[42]和加拿大[43]的器官分配模式发生了变化。

6.2 器官移植时HLA检测的应用在某一潜在供体被确定后且即将进行移植时，需进行HLA供体分型并与受体分型进行比较，因为供体和受体之间的HLA错配程度是刺激同种免疫应答的基础。研究发现，供受体间HLA错配的数量与DSA形成及移植肾排斥反应呈正相关性[44]。以往认为，首次和再次移植发生HLA错配会导致移植结果更差，然而最新数据显示，这种风险仅限于特定的亚组，包括HLA II类分子重复错配的患者及肾切除的患者[45]。一些移植中心使用HLA流式检测的平均荧光强度(MFI)来确定检测的抗体是否应包含在计算机虚拟交叉匹配中，然而MFI并非定量结果，修订的SAB检测法把检测C1q片段用以衡量HLA抗体的补体结合能力，从而确定哪些抗体是有害的[46]。然而这些检测结果均不是绝对的，移植前C1q阴性的DSA未必无害，在某些情况下仍可造成移植物失功及不良后果[47]。因此，任何阳性或阴性结果必须在组织相容性检测结果的背景下解读，以确保假阳性或假阴性结果对移植分配决策的影响降至最低。

7 结语

器官移植前的所有检测都旨在为风险评估提供依据，然而移植实践中的临床风险评估与其他医学领域一样，并非绝对。目前尚无一个检测结果是绝对禁止移植的依据，而是在确定的高风险供者的前提下权衡可能的风险与获益。值得关注的是，基于HLA的同种免疫是高度动态的，且在短期内可能因免疫刺激或免疫抑制的状态而发生改变。鉴于HLA实验室检测结果的复杂性，建议应用动态数据并结合其他临床检测结果为移植风险评估提供依据。