肝癌微环境中FOXP3+调节性T细胞对肿瘤免疫抑制作用的研究

韩丽芳 赵昌林

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）在全球范围内的发病率持续上升，是全球第三大与癌症相关的死亡原因[1]，手术切除和肝移植是早期肝癌的治疗选择，对于晚期患者全身化疗疗效差。HCC患者的预后仍然不容乐观，尤其是处于晚期的患者，肝癌患者5年生存率低于40%[2]，因此，迫切需要揭示肝癌发生发展的相关机制，对完善其治疗策略有重要的意义。

调节性T 淋巴细胞（简称Tregs）调控的抑制是免疫介导的炎症负调节的重要机制，在自身免疫和自身炎症障碍、过敏、急慢性感染、癌症和代谢性炎症中发挥重要作用[3]。Tregs 在肿瘤部位的存在，表明Tregs 可诱导局部免疫耐受。浸润性Tregs 的存在抑制了保护性抗肿瘤免疫反应，并聚集到肿瘤微环境中，与生存率降低相关，从肝癌患者中提取的Treg 比来自健康个体的Treg 更具有抑制性[4]。Treg 介导的抑制可能是免疫干预的重要靶点，阻断Treg 介导的免疫抑制可增强抗肿瘤作用。

肿瘤微环境中存在的调节性淋巴细胞的种类和数量与肿瘤的预后密切相关，有免疫耐受和免疫抑制作用的FOXP3+调节T 细胞作为抗肿瘤免疫中的负性调节因子，已成为肿瘤免疫学研究的热点。T细胞如CD4+FOXP3+和CD4+CD25+FOXP3+，能产生IL-10 和TGF-β，调节免疫系统，阻止自身免疫反应，抑制Th-1、Th-17 和Th-2 细胞。此外，Treg 细胞还可能通过激活其他类型的细胞产生IL-10，诱导效应细胞凋亡和细胞溶解，并调节树突状细胞，从而起免疫抑制作用[5，6]。FOXP3+T 发挥作用的途径及其与抗肿瘤免疫细胞，如CD8+细胞毒性T 细胞之间的相互作用是目前肿瘤免疫学研究领域的难点和关注点之一，因此从该角度出发探索肿瘤免疫很有意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集我院2012年1月～2018年8月的100 例手术患者，经病理师阅片检查确诊为肝细胞癌。采取肝癌组织以及癌旁组织，癌旁组织为距癌结节2cm 以内的肝组织，避开坏死区。纳入标准：术前均未行放化疗等治疗手段；无胰岛素依赖型糖尿病、类风湿关节炎、甲状腺自身免疫病等自身免疫性疾病史者；临床病理资料及随访资料均较完整的患者。

1.2 主要试剂及来源 CD8+鼠抗人单克隆抗体、FOXP3+鼠抗人单克隆抗体购自英国Abcam 公司；柠檬酸盐抗原修复液（pH 6.0），EDTA 抗原修复液（pH 9.0），免疫组化染色试剂盒，羊抗鼠辣根过氧化物酶标记的EliVision 二抗等试剂购自碧云天生物科技有限公司；Trizol Reagent 购自美国Invitrogen公司；cDNA 第一链合成试剂盒、SYBR Green、荧光定量PCR 相关材料购自北京天根公司。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化实验 组织经10%甲醛固定24h 后，石蜡包埋，将石蜡组织块4μm 连续切片，放60℃恒温箱烘烤过夜，以防脱片；石蜡切片脱蜡、水化；PBS 洗涤3 次，每次5min；组织切片置于pH 9.0 EDTA 中进行组织抗原微波修复，先高火煮沸后改为中低火，持续30min，在室温下冷却15min；PBS 洗3 次，每次5min；0.3%过氧化氢室温20min；PBS 洗3 次，每次5min；抗体孵育4℃过夜；PBS 洗3 次，每次5min；滴加100μl 二抗放大剂室温10min；PBS洗3 次，每次5min；滴加100μl 二抗多聚酶结合物室温10min；PBS 洗3 次，每次5min；滴加100μl DAB 显色3～5min，自来水冲洗3min；苏木素细胞核复染20s，自来水洗10s；浸泡PBS 中15min 返蓝；干燥、封片观察。

1.3.2 免疫组化结果判定 FOXP3+细胞阳性染色镜下观察到细胞核棕黄色或者棕褐色，CD8+T 淋巴细胞阳性染色表现为细胞膜和细胞浆棕黄色或棕褐色着色；先低倍镜下选取5 个淋巴细胞最丰富的视野，再高倍镜视野下计各细胞的阳性细胞数，结果取5 个视野的平均值。同时分别计算同一视野内FOXP3+T 细胞/CD8+T 细胞值。

1.3.3 IL-10 转录表达检测 按照Trizol reagent 说明书提取细胞总RNA，检测RNA 浓度和纯度。按cDNA 第一链合成试剂盒说明将RNA 逆转录合成cDNA 后，按SYBR Green 荧光法进行PCR 反应，反应程序：95℃ 2min，95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 30s，共40 个循环，每次退火之后采集荧光信号。反应以β-actin 为内参照。IL-10 的引物序列为：上游：5'-ACTTGGCAGTGTGGTAGCAG-3'，下游：5'-TGAA CTTGGCAGGCTCGTAA-3'。各组设置3 个复孔，并设置空白对照，记录各孔CT 值，并采用2-ΔΔCt法对结果进行分析。

1.4 统计学方法 全部实验数据均采用SPSS 20.0软件进行处理，分析组间差异。计量资料用±s表示，差异显著性采用独立样本t检验。差异显著性判断标准：P＜0.01 为差异极显著，P＜0.05 为差异显著，P＞0.05 为差异不显著。

2 结果

2.1 肝癌及癌旁组织中FOXP3+T 细胞和CD8+T 细胞的分布状态 肿瘤组织内的FOXP3+和CD8+T淋巴细胞呈现出弥散分布状况，多存在于癌巢及间质组织中，镜下未观察到明显的集中分布趋势；而癌旁组织中却见到大量的FOXP3+和CD8+T 淋巴细胞密集分布，呈淋巴样聚集趋势。

2.2 肝癌及癌旁组织中FOXP3+T 细胞和CD8+T 细胞的数量分布及二者比值 免疫组化结果显示，肝癌及癌旁组织中FOXP3+T 细胞阳性单个高倍视野平均数分别为26.7±6.2 和53.3±8.7，二者比较差异极显著（P=0.0074）；肝癌及癌旁组织中CD8+T 细胞阳性单个高倍视野平均数分别为51.3±7.1 和125.0±10.3，差异极显著（P=0.0005）。肝癌及癌旁组织中FOXP3+T/CD8+T 值分别为0.519±0.06 和0.422±0.02，差异显著（P=0.017）。

2.3 肝癌及癌旁组织中IL-10 转录表达水平 QPCR 检测肝癌及癌旁组织中IL-10 转录表达水平，结果显示：癌组织中IL-10 mRNA 相对表达量为1.000±0.061，癌旁组织中为0.269±0.034，差异极显著（P=0.0001）。

3 讨论

肝细胞癌（HCC）发生率占原发性肝癌的90%以上，是主要的公共卫生问题[7]，该病常发生于慢性乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染。随着慢性乙肝病毒和丙型肝炎病毒感染的频率越来越高，越来越多的人在以后的生活中面临着肝癌的高风险[8]。如何有效防治HCC 成为研究的热点和难点，而FOXP3+调节性T 细胞在肿瘤免疫中发挥的作用近年来成为一个关注点，研究表明，FOXP3+T 调控肿瘤免疫的主要途径有两条，一是通过细胞与细胞间的直接接触发挥细胞抑制作用；另一个则是通过分泌一些细胞抑制因子如IL-10 等抑制细胞毒性T 细胞（CD8+）和自然杀伤细胞（NK）的活化、增殖而发挥其负性免疫调控作用[9]。而CD8+细胞在抗肿瘤反应中发挥着重要的作用，在局部抗肿瘤免疫中处于机体免疫系统与肿瘤相互作用的最前沿，其数量和功能等特征在一定程度上反映了机体抗肿瘤反应的性质、强度和总体水平[10]。因此检测FOXP3+T 和CD8+T 细胞的数量，能直观地体现出肿瘤微环境中机体免疫水平的高低。本实验中，肿瘤组织内的FOXP3+和CD8+T 淋巴细胞呈现出弥散分布状况，而癌旁组织中却见到大量的FOXP3+和CD8+T 淋巴细胞密集分布，呈淋巴样聚集趋势。因此肝癌组织中FOXP3+T 细胞和CD8+T细胞阳性数量显著低于癌旁组织，而二者的比值在肝癌组织中显著高于癌旁组织中。有研究发现，肿瘤组织中FOXP3+T 和CD8+T 细胞与乳腺癌的组织病理学分级、ER、PR 表达状态有显著相关性，癌旁组织中FOXP3+T 与ER 表达显著负相关，且肿瘤组织中FOXP3+T 数量、癌旁组织中FOXP3+T/CD8+T细胞比值是乳腺癌患者总生存率及无复发生存率的独立预后因素[11]。研究表明，肿瘤微环境中浸润的FOXP3+调节性T 细胞与患者的关系密切，FOXP3+T 细胞表达升高的患者总体生存率比低表达的患者差[12]，而CD8+T 细胞是机体重要的免疫细胞，能特异性杀伤肿瘤细胞，起到抗肿瘤的效果。本结果中，肿瘤组织中FOXP3+和CD8+T 细胞比值显著高于癌旁组织，和前述研究相符，也与两组细胞的功能密切相关。

目前，有学者认为FOXP3+T 细胞在机体中起免疫抑制作用的途径，可能是通过抑制性细胞因子（TGF-β、IL-10 等）的分泌来降低机体对肿瘤抗原的反应及降低效应细胞的肿瘤杀伤作用[13]。同时，还有研究表明IL-10 是一个与甲状腺癌相关的细胞因子，甲状腺癌细胞产生高水平的IL-10，甲状腺细胞产生IL-10 是在肿瘤转化过程中获得的，在正常甲状腺组织中，只检测到IL-4 和IL-10 受体，并未检测到这种细胞因子，因此IL-10 能够促进甲状腺癌的发生发展[14]。而且IL-10 可由多种癌细胞自发分泌，包括黑色素瘤和胶质母细胞瘤等，在这些癌细胞中，IL-10 被认为可以促进肿瘤细胞的生存、增殖和迁移[15，16]。由此可知，IL-10 的表达和肿瘤免疫抑制密切相关，通过抑制机体免疫功能来促进肿瘤发展。本研究结果显示，肝癌组织中FOXP3+T 细胞阳性数量显著低于癌旁组织，肿瘤组织内的FOXP3+T 淋巴细胞呈现出弥散分布状况，癌旁组织中呈淋巴样聚集趋势，猜测在肝细胞癌组织中，FOXP3+T 淋巴细胞可能通过细胞接触非依赖性机制发挥免疫抑制作用，从而促进肿瘤的发生发展，即通过分泌细胞抑制因子如IL-10 等发挥作用，为了验证这一猜测，我们检测了肿瘤组织和癌旁组织中的IL-10 转录表达水平。结果发现，癌组织中IL-10 mRNA 相对表达量显著高于癌旁组织，本结果和以往研究结果相符合，表明IL-10 在肝细胞癌的发生发展中起重要作用。

本研究探讨了FOXP3+T 细胞与肿瘤免疫的关系，发现其数量及其分泌的免疫抑制因子IL-10 对肿瘤免疫起抑制作用，但本研究未具体探讨其调节机制或控制Treg 增殖的有效方法，期待能够做进一步的研究，为设计更有效的抗肿瘤免疫疗法提供依据。