多频超声波辅助磷脂酶处理对菜籽油脱胶效果及品质的影响

徐保国， 魏本喜， 齐文慧， 任晓锋*， 周存山， 马海乐

（1．江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江212013；2.江苏大学 农产品加工工程研究院，江苏 镇江 212013）

油菜籽经过物理压榨和溶剂浸提等方法所得到的油，称为菜籽毛油。菜籽毛油中含有多种杂质，如磷脂、蛋白质、糖类、色素、游离脂肪酸等，需要经过一系列精炼工序后才能食用[1]。在油脂的精炼加工过程中，脱胶是第一个工序，其主要目的是脱除毛油中的磷脂、糖、蛋白质等胶质混合物，其中磷脂是这些胶质中的主要成分，因此脱胶也被称为脱磷。

脱胶过程如果不彻底，会严重影响油脂后续精炼工序的正常进行，如影响油脂碱炼、导致油脂脱色后色度回升、脱臭工序中的高温易导致磷脂焦化变黑而加深油脂色泽[2]；此外，在精炼后油脂的储藏过程中，磷脂的存在会造成油脂返色[3]和回味[4]等现象，严重影响产品的品质。传统的脱胶方法包括水化脱胶和酸法脱胶两大种。水化脱胶可以去除大部分与磷脂相结合的胶质类物质，而菜籽毛油中的磷脂分为水化磷脂和非水化磷脂，水化脱胶仅能脱除水化磷脂，而非水化磷脂仍残留在油脂中，难以满足精炼的要求；酸法脱胶可以通过添加一定量的酸，将毛油中与金属离子结合的非水化磷脂转化成水化磷脂，再加入适量的水将其去除，酸法脱胶大大降低了脱胶油的磷质量分数，但是这种方法所达到的脱胶效果大多数都不能满足物理精炼的要求（磷质量分数＜10 mg/kg）[5-6]。

为了提高脱胶效果，研究人员一直致力于新型脱胶方法的开发，如超临界CO2脱胶[7]、超滤脱胶[8]和酶法脱胶[9-10]等。其中，酶法脱胶因其反应条件温和、中性油损失少、油脂得率高和绿色环保等优点备受关注。虽然酶法脱胶有很好的脱胶效果，但脱胶反应时间较长（4.0～6.5 h）[11-12]，因而制约了酶法脱胶在油脂精炼工业中的应用。为了缩短酶法脱胶时间，提高脱胶效率，将超声波技术引入酶法脱胶的过程当中。本团队的前期研究主要考察了磷脂酶A1和超声辅助磷脂酶A1对菜籽油脱胶效果的影响[9]，作者在前期实验的基础上，更加系统地研究了多频超声辅助磷脂酶A1对菜籽油的脱胶效果以及脱胶后油的品质变化的影响，以期为超声波在酶法脱胶工业生产中的应用提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

菜籽毛油：江苏金太阳粮油股份有限公司提供，含磷质量分数为（467.32±4.79） mg/kg；磷脂酶A1：杰能科（中国）酶制剂有限公司，酶活为10 KLU/g。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 多频超声波装置：江苏大学研制；氧化稳定仪：Rancimat 743，瑞士万通公司；马弗炉：SX2-4-10-S，上海帅登仪器有限公司；旋转蒸发仪：RE-6000A，上海皖宁精密科学仪器有限公司；气质联用仪：GCMS-QP2010 ULTRA，日本岛津公司；离心机：LD5-2A，北京医用离心机厂。

1.2.2 主要试剂 柠檬酸、氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、氧化锌、硫代硫酸钠、碘化钾、钼酸钠、硫酸联氨、甲醇、乙醇、乙酸等药品和试剂：分析纯，国药集团上海化学试剂公司生产。

1.3 实验方案

根据之前的操作步骤[9]，具体如下：称取100 g菜籽毛油，放入250 mL的锥形瓶中，恒温水浴加热到80℃，然后，添加质量浓度为40 g/dL的柠檬酸溶液0.13 mL，10 000 r/min均质1 min，结束后在80℃水浴下以500 r/min的转速搅拌30 min，再加入一定量NaOH溶液（4 mol/L），调节pH至设定值（4.2～5.4），搅拌均匀后，边搅拌边加入一定量的去离子水（1%～5%）和磷脂酶 A1（10～150 μL/kg），将锥形瓶置于多频超声波发生装置上进行反应，超声的条件分别为：20、50、20/50、20/35/50 kHz 的不同超声频率组合，超声功率为180 W，超声的脉冲方式为10 s工作/3 s间隙，设置温度为设定值（20～60℃），待酶法脱胶反应到设定的时间后 （10～120 min），将菜籽油的温度升高至90℃，灭酶10 min，在8 000 r/min的转速下离心10 min，收集上层油层，再旋转蒸发浓缩得到脱胶菜籽油。其中对照组的过程与上述一致，但不采用超声波作用。

1.4 指标测定方法

1.4.1 菜籽油含磷量测定 根据GB/T 5537-2008《粮油检验 磷脂含量的测定》法进行。

1.4.2 菜籽油品质分析 油脂酸值测定：采用GB/T 5530-2005法；油脂碘价测定：采用GB/T 5532-2008法；油脂色泽测定：采用GB/T 22460-2008法；油脂过氧化值测定：采用GB/T 5538-2005法；油脂氧化稳定性的测定（OSI值）：参照Xu等[13-14]方法进行；菜籽油脂肪酸组成测定：参照文献[15]。

1.5 统计分析

至少重复3次试验，数据以平均值±标准偏差表示，采用SPSS 18.0软件中的Ducan程序进行数据方差分析。

2 结果与分析

2.1 多频超声波辅助磷脂酶对菜籽油脱胶效果的影响

2.1.1 加酶量对多频超声酶法脱胶效果的影响磷脂酶A1的添加量对不同频率超声辅助脱除菜籽油中磷脂的效果见图1。具体反应条件为：反应温度40℃，pH 4.8，加水量2%，超声波功率180 W，搅拌速度500 r/min，反应时间90 min。

从图1可以看出，随着磷脂酶A1添加量的增加，所有处理方式下，菜籽油的含磷质量分数均呈现出明显的下降趋势；且当磷脂酶A1的添加量达到90 μL/kg时，再继续增加酶的添加量，菜籽油中的含磷质量分数下降趋势变得缓和。此外，图1还显示了超声波作用可显著提高菜籽油中含磷质量分数的降低速率，同时还可以大大降低菜籽油中含磷质量分数的幅度。当酶用量为90 μL/kg时，对照组的含磷质量分数为18.77 mg/kg，而超声作用的菜籽油含磷质量分数均降低至8 mg/kg以下。这可能是因为超声波的机械效应给酶解反应体系提供了有效的推动力，促进了油水两相的混合，并且超声波具有较强的乳化[16]和分散作用[17-18]，可以使反应体系更为均匀，有效地提高底物与磷脂酶A1的接触机率，从而提高酶的反应效率。

图1还显示了不同超声频率作用下菜籽油的脱胶效果，其中，20/50 kHz双频组合作用下菜籽油的脱胶效果最好，其次分别为20/30/50 kHz三频组合、50 kHz和20 kHz。这说明了不同的超声频率对菜籽油的酶法脱胶效果有不同的影响，且存在最佳的脱胶频率。冯若等[19]研究表明，以频率为fa的超声波作用于体系，只有那些体系共振频率fT接近于fa，体系才能对声场积极响应，声化学产额才能达到最佳。此处，可能是因为20/50 kHz双频频率组合更加接近菜籽油酶法反应体系的共振频率，所以相对其他几种频率超声作用而言，20/50 kHz作用下的脱胶效果更明显。

2.1.2 反应时间对多频超声酶法脱胶效果的影响图2显示了反应时间对不同频率超声辅助脱除菜籽油中磷脂的效果，具体反应条件为：反应温度40℃，pH 4.8，加水量 2%，加酶量 90 μL/kg，超声波功率180 W，搅拌速度500 r/min。

图1 加酶量对多频超声酶法脱胶效果的影响Fig.1 Effect of enzyme dosage on the ultrasound assisted enzymatic degumming efficiency

由图2可知，随着反应时间的延长，菜籽油的含磷质量分数持续下降。当反应时间为10 min时，对照组的含磷质量分数为41.25 mg/kg，而不同频率超声作用下的菜籽油含磷质量分数均降至20 mg/kg以下；当反应时间延长至120 min时，对照组的含磷质量分数为15.44 mg/kg，仍未能满足菜籽油物理精炼的要求（残磷量＜10 mg/kg）[5]，而 20/50 kHz 双频超声作用30 min时，菜籽油的含磷量降至9.83 mg/kg；当作用时间为60 min时，所有频率超声作用下的菜籽油含磷质量分数均降至10 mg/kg以下，且继续延长作用时间，含磷质量分数的下降幅度不明显。这说明了超声作用可以很大程度上缩短菜籽油脱胶反应的时间，且有效降低了菜籽油的含磷质量分数。

图2 反应时间对多频超声酶法脱胶效果的影响Fig.2 Effect of reaction time on the ultrasound assisted enzymatic degumming efficiency

2.1.3 体系pH对多频超声酶法脱胶效果的影响图3显示了体系pH值对不同频率超声辅助脱除菜籽油中磷脂的效果。具体反应条件为：反应温度40℃，加水量2%，加酶量90 μL/kg，超声波功率180 W，搅拌速度500 r/min，反应时间90 min。

在酶与底物反应体系中，pH值影响着酶分子活性部位的带电基团与底物的结合，当pH值偏高或偏低时，酶活性部位的带电属性会产生改变，降低酶与底物的结合能力，从而影响反应体系的酶解效果。由图3可知，随着pH值的升高，菜籽油的含磷质量分数呈现出先降低后升高的趋势。当pH值为4.8时，所有处理条件下菜籽油中的含磷质量分数均达到最低值；其中，对照组的含磷质量分数为18.77 mg/kg，20/50 kHz双频超声作用下的含磷质量分数最低，为3.94 mg/kg。

图3 体系pH值对多频超声酶法脱胶效果的影响Fig.3 Effect of pH on the ultrasound assisted enzymatic degumming efficiency

2.1.4 反应温度对多频超声酶法脱胶效果的影响图4显示了反应体系温度对不同频率超声辅助脱除菜籽油中磷脂的效果，具体反应条件为：pH 4.8，加水量2%，加酶量 90 μL/kg，超声波功率 180 W，搅拌速度500 r/min，反应时间90 min。

温度是影响酶活性的重要因素之一。随着反应体系温度的升高，菜籽油含磷质量分数呈现出先降低后升高的趋势。当体系温度从20℃升高至40℃时，对照组菜籽油的含磷质量分数从25.33 mg/kg下降到最低18.77 mg/kg；随后温度不断升高，菜籽油的含磷质量分数又呈现出上升的趋势，当温度为60℃时，含磷质量分数为32.33 mg/kg。这说明了对照组体系中，磷脂酶A1的最适温度为40℃，而温度升至60℃时，酶活性大大降低，导致含磷质量分数升高。此外，相比较于对照组，超声波辅助磷脂酶脱胶可以大大降低菜籽油中的含磷质量分数。

图4 反应温度对多频超声酶法脱胶效果的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on the ultrasound assisted enzymatic degumming efficiency

2.1.5 加水量对多频超声酶法脱胶效果的影响图5显示了加水量对不同频率超声辅助脱除菜籽油中磷脂的效果，具体反应条件为：反应温度40℃，pH 4.8，加酶量 90 μL/kg，超声波功率 180 W，搅拌速度500 r/min，反应时间90 min。

从图5可以看出，对照组在3%的加水量下，菜籽油中的含磷质量分数达到最低，为17.65 mg/kg；而在超声辅助磷脂酶脱胶的反应体系中，最适的加水量为2%，这是因为超声波的机械作用可以提高体系的传质效率，使水的利用变得更加有效。此外，当加水量达到5%时，菜籽油中的含磷质量分数反而升高，这可能是因为过高的水分造成了磷脂的乳化，影响了脱胶的效果，同时也增加了后期实验中分离的难度[9]。

图5 加水量对多频超声酶法脱胶效果的影响Fig.5 Effect of water amount on the ultrasound assisted enzymatic degumming efficiency

2.2 多频超声波辅助磷脂酶对脱胶后菜籽油品质的影响

2.2.1 脱胶后菜籽油品质指标的变化 表1显示了多频超声波辅助磷脂酶对脱胶后菜籽油酸值、碘价、过氧化值和氧化稳定性等指标的影响，具体反应条件为：反应温度40℃，pH 4.8，加水量2%，加酶量90 μL/kg，超声波功率180 W，搅拌速度500 r/min，反应时间90 min。

由表1可以看出，与原菜籽油样品相比，经过磷脂酶A1脱胶和超声辅助磷脂酶A1脱胶处理后，所得菜籽油的酸价显著上升（p＜0.05），这可能是因为油脂中部分脂肪酸甘油酯在脱胶过程中被磷脂酶A1水解成游离脂肪酸，导致油脂酸价上升[20]；相比较于对照组，超声辅助磷脂酶A1作用后的菜籽油酸价均未发生显著性变化（p＞0.05）。过氧化值的变化趋势与酸价类似，脱胶后的菜籽油过氧化值显著上升（p＜0.05），且经超声作用后的脱胶油过氧化值比对照组略有提升；此外，脱胶后的菜籽油OSI值显著降低（p＜0.05），且 20/50 kHz 超声处理组的OSI值显著低于对照组（p＜0.05），这说明了超声作用在一定程度上加速了菜籽油的氧化变质[5]。除此之外，脱胶后菜籽油的碘价也显著降低（p＜0.05）。尽管脱胶后菜籽油的酸值、碘价和过氧化值都发生了显著变化，但是均在国家标准（GB 1536-2004）所规定的安全范围内。

色泽、气味和滋味是消费者判断食用油品质的重要标准。从表1可以看出，菜籽毛油的色泽为黄35和红7.0，脱胶后菜籽油的色泽为黄28和红4.0（对照组），说明了脱胶处理后菜籽毛油的色泽变浅；与对照组相比，超声辅助处理的菜籽油色泽黄值和红值都略有下降，达到国标GB 1536-2004规定的三级油的标准。此外，在气味和滋味方面，脱胶后的菜籽油未产生特殊的气味和滋味。

表1 多频超声波辅助磷脂酶对脱胶后菜籽油酸值、碘价、过氧化值和氧化稳定性等指标的影响Table 1 Effect of ultrasound assisted enzymatic degumming on the acid values，iodine values，peroxide values and oxidative stability of rapeseed oil

2.2.2 脱胶后菜籽油的脂肪酸组成变化 图6显示了多频超声波辅助磷脂酶脱胶后菜籽油的脂肪酸组成图谱，经解谱后得到表2。由表2可以看出，与原油样相比，磷脂酶A1和超声辅助磷脂酶A1脱胶后的菜籽油中亚麻酸（C18：3）、花生一烯酸（C20：1）和芥酸（C22：1）的质量分数略有下降，下降幅度分别在 0.9%、0.5%和 2.0%；棕榈酸（C16：0）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1）和亚油酸（C18：2）的质量分数有所上升，上升幅度分别在0.4%、0.5%、2.8%和0.9%。此外，饱和脂肪酸质量分数和单不饱和脂肪酸质量分数有所上升，多不饱和脂肪酸质量分数略有下降。综合分析，对比原油样的实验数据发现，脱胶后的菜籽油各脂肪酸数值的上升和下降幅度都不明显，均在3%以内；与对照组相比，超声辅助处理所得的菜籽油各脂肪酸数值的上升和下降幅度非常小，说明超声辅助处理对菜籽油脂肪酸质量分数影响不显著。

图6 多频超声波辅助磷脂酶脱胶后菜籽油的脂肪酸组成图谱Fig.6 Pictures of fatty acid compositions of rapeseed oil after ultrasound assisted enzymatic degumming

表2 多频超声波辅助磷脂酶对脱胶后菜籽油脂肪酸组成的影响Table 2 Effect of ultrasound assisted enzymatic degumming on the fatty acid compositions of rapeseed oil

3 结 语

作者研究了多频超声波辅助酶法对菜籽油脱胶效果及其品质的影响，通过与常规酶法脱胶进行对比，得出如下结论：

1）超声波处理能显著提高磷脂酶A1对菜籽油的脱胶效率，显著降低脱胶后菜籽油中的含磷质量分数；不同的超声波频率对磷脂酶A1的脱胶效果有明显差异，其中20/50 kHz双频处理对磷脂酶A1脱胶效果最佳；在反应温度40℃、pH 4.8，加水量2%，加酶量90 μL/kg，超声波功率180 W，搅拌速度500 r/min的条件下，20/50 kHz双频处理仅需30 min便可使菜籽油中的含磷质量分数降至安全标准范围内。

2）与常规酶法脱胶后菜籽油对比，超声波作用后的脱胶菜籽油酸价和过氧化值略有上升（但均在国家标准所规定的安全范围内），氧化稳定性下降，色泽变浅；在脂肪酸组成上，数值有所上升和下降，但幅度均不显著。实验证明了超声波在菜籽毛油脱胶的加工当中有很好的应用前景。