苏云金芽孢杆菌的鉴定

◎ 梁梅娟，苏佩冰，殷 欢，陈靖欣

（中山市食品药品检验所，广东 中山 528437）

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）被发现已有100年的历史，其在害虫防治中发挥了巨大的作用，是近年来研究最深入、开发最迅速、应用最广泛的微生物杀虫剂。Bt的防虫原理是其菌株可产生内毒素（伴孢晶体）和外毒素两类毒素，使害虫停止取食，害虫均因饥饿、细胞壁破裂、血液败坏和神经中毒而死。近年来，国内外学者对苏云金杆菌的菌种资料、分类鉴定、伴孢晶体结构、血清学特征等方面均进行了广泛而深入的研究[1]。

Bt与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，Bc）同属于蜡状芽孢杆菌菌群，为自然界中广泛分布的革兰阳性菌[2]。Bt与Bc在DNA水平上具有较高的同源性，只有个别碱基有差异，此外，Bt与Bc还有相似的生化特征，区别在于Bt能产生伴孢晶体[3]。目前，对于Bt的鉴定一般运用传统的生化试验来进行，耗时较长，试验结果不稳定且不易与Bc区分。基因指纹分析（Ribo Printer，RP）系统是杜邦公司研发的一种全自动细菌鉴别系统，该系统建立在对核糖体DNA序列多态性分析之上[4]，可以全自动完成细菌鉴定的一系列实验。本文参考GB 4789.14-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》[5]，运用传统的生化试验结合VITECK-2-compact及RP系统对Bt进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 实验材料

（1）菌株。Bt（A TCC 10792）、Bc[CMCC（B）63303]、蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides，Bm）（ATCC 10206）。

（2）培养基。营养琼脂（NA）培养基、酪蛋白琼脂培养基、硫酸锰营养琼脂培养基。

（3）试剂。陆桥蜡样芽胞杆菌生化鉴定盒、革兰氏阳性细菌鉴定卡BCL卡、RiboPrinter鉴定试剂盒及配套试剂（裂解液：苯酚：氯仿：异戊醇 =25∶24∶1）。

（4）仪器。VITECK-2-compact全自动细菌鉴定仪、RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化

将菌株划线接种于营养琼脂平板，（30±1）℃培养（24±2）h。

1.2.2 菌种的鉴定

（1）镜检.挑取NA平板上的单个菌落，涂片，革兰氏染色后镜检。

（2）生化特征反应。过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、溶菌酶耐性试验、葡萄糖利用（厌氧）、V-P试验、甘露醇试验、明胶试验以及西蒙氏柠檬酸盐试验均来自陆桥蜡样芽孢鉴定试剂盒，操作步骤参照试剂盒说明书进行。

（3）酪蛋白分解和溶血试验。挑取单菌落分别接种于酪蛋白琼脂培养基和TSSB琼脂平板上，（30±1）℃培养（24±2）h，观察菌落性状。

（4）根状生长试验。挑取单个菌落按间隔2～3 cm的距离划平行直线于营养琼脂平板上，（30±1）℃培养（24±2）h，观察生长情况。

（5）蛋白质毒素结晶试验方法。参照GB 4789.14-2003进行。结晶试验过程中的注意事项：培养完的菌株需室温放置3 d以上，挑取少许培养物均匀涂在玻片上形成薄膜；在染色过程中，滴上碱性复红后放在火焰上加热的时候，需要注意不能让染色液沸腾或者烧干，适当的时候需要添加染液；最后要把玻片冲洗干净。

（6）VITECK-2-compact。使用BCL鉴定卡进行鉴定，时间为14.25 h，具体步骤按照操作规程以及BCL鉴定卡说明书和相关文献资料进行[6-7]。

（7）RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统。在1.5 mL PCR管中加入40 μL缓冲溶液，用取样棒挑取待测菌株的单菌落2～3个，混合均匀，95 ℃加热25 min，加入5 μL裂解液，放置于样品孔中并运行程序，选用EcoRⅠ酶切系统。将上机得出的杂交图谱与Dupont ID数据库比对，得到菌株信息。

2 结果与分析

2.1 形态分析

Bt在NA上菌落为圆形或者椭圆形，淡黄色，边缘不规则，不透明微隆起呈滴蜡状。Bc在NA上的形态为淡黄色，不透明，边缘不规则，呈滴蜡状或毛玻璃状。Bm为白色菌落，边缘不规则，菌落表面有绒毛生长。

Bt菌体在显微镜下呈紫色椭圆形杆状，大小为（1.2～1.8）μm×（3.0～5.0）μm，呈短链或者长链状排列，芽孢为椭圆形，靠近中间生长，芽孢囊微膨大。Bc菌体在显微镜下呈紫色椭圆形杆状，大小为（1.0～1.3）μm×（3.0～5.0）μm，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或者两端，不会膨大于菌体，多呈短链或者长链状排列。Bm菌体在显微镜下呈长杆状，两端为圆形，呈链状排列，芽孢为椭圆形，靠近中生。

所观察到形态现象都符合伯杰细菌手册所记录的形态特征。根据形态，可将Bm区分出来，但Bt和Bc两者的形态很接近，很难区分。

2.2 生理生化试验

对菌株进行了12项生化试验，结果见表1。Bt的多数生化特征与Bc、Bm都是相同的：过氧化氢酶阳性，硝酸盐还原阳性，溶菌酶耐性阳性，V-P反应阳性，葡萄糖发酵都产酸，对甘露醇都不发酵酸，动力试验都没有扩散生长，明胶试验阳性。生化特征显著不同的是：Bt和Bc都分解酪蛋白，Bm不分解酪蛋白；溶血试验：Bt和Bc都有明显的溶血环，而Bm只是呈现很弱的溶血现象；Bt和Bc呈粗糙山谷状生长，Bm呈根状生长特征；西蒙氏柠檬酸盐试验只有Bc是阳性。

表1 Bt与其他芽孢杆菌生化特征的区别表

2.3 蛋白质毒素结晶试验

伴孢晶体的形成是Bt的重要生化特征，也是其在微生物分类时的重要依据[8]。在显微镜下明显能观察到Bt有游离芽孢和深红色的菱形蛋白晶体，见图1，而Bc和Bm只观察到游离芽孢。

图1 Bt的伴孢晶体染色图

2.4 VITECK-2-compact鉴定结果

VITECK-2-compact是应用经典的生化反应进行细菌鉴定的全自动仪器。Bt、Bc和Bm经BCL TEST KIT VITEK 2鉴定，鉴定结果都是显示Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides。结果分析表明，VITECK-2-compact所运用的生化反应不能把这3种芽孢杆菌单独鉴定出来，要确定待测菌株是否为Bt，需要补充蛋白质结晶试验，详细分析见表2。

表2 VITECK-2-compact鉴定结果分析表

2.5 RP系统对待测菌株的鉴定结果

待测菌株ATCC10792、CMCC（B）63303和ATCC 10206经过RP系统分析都出现了清晰的DNA指纹图谱。结果表明，数据库中与待测菌株ATCC 10792、CMCC（B）63303和 ATCC 10206与 Dupont相 似度较高的菌株分别为Bt、Bc和Bm，相识度均达到90%以上。

用RP系统对Bt的鉴定，避免了其他因素的干扰，用时较短，8 h就可以得出结果。表3就是经过RP系统对Bt分析出来的结果，从表3中可以看出，第6组是待测菌株ATCC 10792的基因指纹图谱，第1～5组是待测菌株与数据库中基因指纹图谱相识度较高的基因条带。从图中第3组和第4组可知，Bt与Bc的基因条带的相识度比较高。不过从表3的结果分析图上可以得出运用RP系统鉴定Bt，还需要结合其生化反应才能确认最终结果。

表3 Bt的鉴定结果分析表（基因指纹图谱）

3 结论

无论是运用全自动细菌鉴定分析仪还是RP系统鉴定Bt，最终都需要结合革兰氏染色镜检和蛋白毒素结晶试验，才能确定待测菌株为Bt。如果三者皆符合，则确认该菌株为Bt，如果其中之一不符合，则被否定。因为无论是运用RP系统和全自动生化分析仪对Bt进行鉴定，最终得出的结果都是需要结合其特征生化反应来确认结果。通过革兰氏染色镜检进一步确认菌株的形态，蛋白毒素结晶试验是Bt的生化特征反应，因此需要结合这两项试验才能确认最终结果。

全自动生化分析仪所用实验时间长一些，并且不能把苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌分出来。RP系统与全自动生化鉴定仪鉴定比较，RP系统用时较短且准确性较高，但成本也较高，试剂耗材较贵，每次要运行8个样品，而且制备样品条时纯培养物的取样量要掌握好，才能出现比较好的DNA指纹图谱。

Bt对于农作物防治害虫有重大的作用，随着科学技术水平的提高和对Bt研究的深入，新的鉴定方法会不断涌现，基因分析鉴定方法也会更完善，普及范围更广，检测成本更低，有利于提高鉴定效率，推动杀虫剂相关产业的发展。采用基因工程技术筛选、分离Bt菌株应该是将来的对于Bt鉴定的主要研究方向[9]，本研究结果也为这项技术提供一定的理论依据。此外，伴孢晶体形成是Bt的重要特征，在RP系统的基础上进行蛋白毒素结晶试验，有利于提高鉴定效率。