高尿酸血症患者尿液外泌体源性microRNA表达谱的初步研究

胡艳艳 徐红 朱仁杰 杨汝春 陈坚翱

1浙江中医药大学附属嘉兴中医院（浙江嘉兴 314001）；2浙江中医药大学附属广兴医院（杭州 310007）；3浙江中医药大学（杭州 310053）

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是人体内嘌呤代谢发生紊乱，致使血液中尿酸增高而引起的一种代谢性疾病。随着我国社会经济发展，人们生活方式及饮食结构改变，高尿酸血症的患病率逐年增高，并呈年轻化趋势，已成为仅次于糖尿病的第二大代谢性疾病［1］。有研究发现，在细胞、动物水平，及高尿酸血症患者血液中不同的microRNA可能参与了高尿酸血症的多个病理过程，如抑制血管再生、形成尿酸盐结晶、损伤肾功能等，从而在一定程度上影响高尿酸血症的发生发展［2］，但其发病机制目前仍不十分清楚。

1 对象与方法

1.1研究对象本研究经浙江中医药大学附属广兴医院伦理委员会批准，收集2016年7-12月期间就诊于浙江中医药大学附属广兴医院的原发性无症状高尿酸血症患者及体检中心的健康人群，获得受试者知情同意并签署知情同意书，每组3例。其中男5例，女1例，年龄24～28周岁。

1.2主要实验试剂和仪器设备TRIzol LS Re-agent（美国Invitrogent公司），超速离心机（Optima XPN-90美国Beckman公司），Illumina NexSeq 500（美国Illumina公司）；PMSF（Amresco 0754 Biosharp公司），Leupeptin（Amresco J580 Biosharp公司），DTT（Amresco 0281 Biosharp公司）等。

1.3实验方法

1.3.1尿液外泌体分离每位受试者收集随机中段尿液标本140 mL，每70 mL尿液中加入350 μL 0.1 mol/L的PMSF和42 μL 0.001 mol/L的Leupeptin，通过超速离心机低温差速离心法（4℃17 000×g离心30 min；4 ℃ 200 000×g离心60 min）收集外泌体，每70 mL尿液管底沉淀物用56 μL 0.01 mol/L的PBS缓冲液悬浮混匀后加入等体积含60 mg/mL DTT的上样缓冲液；于恒温水浴箱中60℃加热10 min；最后置于-80℃冰箱储存备用。

1.3.2样本总RNA的抽提使用TRIzol法提取外泌体中的总RNA，用NanoDrop ND-1000测定样本总RNA浓度和纯度。

1.3.3microRNA表达谱测序在每个样本总RNA的3′和5′端添加RNA接头，使用Illumina RT引物和扩增引物进行反转录扩增，随后从PAGE胶上挑选130～150 bp的PCR扩增片段，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer定量文库。再将样本滴定到最终浓度8 pmol/L，并根据Illumina NexSeq 500说明书，使用TruSeq Rapid SR cluster Kit在Illumina cBot上进行簇生成。最后使用TruSeq Rapid SBS Kit在Illumina NextSeq 500测序仪上进行50个周期的测序。再计算两组样品间各microRNA的差异倍数（Fold change），把区别两组间差异表达的阈值设定为1.5倍，即上调＞1.5倍的，Fold Change＞1.5，下调＞ 1.5倍的，Fold Change＜ 1/1.5（0.67），组间参数检验应用t检验，非参数检验应用Mann-Whitney秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，最后根据Fold Change和P值筛选差异microRNA，绘制microRNA聚类图。该测序过程主要由上海康成生物有限公司完成。

1.3.4实时荧光定量PCR先将microRNA逆转录成cDNA，然后使用引物设计软件Primer 5.0设计microRNA与内参基因U6的反应引物，再通过384-PCR板于Real-time PCR仪上进行PCR反应。利用2-△△CT方法分析microRNA相对表达量，再将2-△△CT与Fold change进行比较，验证microRNA高通量测序结果的准确性。

2 结果

2.1样品总RNA浓度和纯度检测结果外泌体总RNA经NanoDrop ND-1000检测，OD260/OD280在1.68～1.74之间，接近于1.80，OD260/OD230均＞ 1.8，基本满足后续microRNA测序及PCR要求。

2.2microRNA表达谱结果通过高通量测序成功构建高尿酸血症组和正常对照组尿液外泌体源性microRNA表达谱，共筛选出表达差异的已知microRNA 10种（表1），其中1种上调，为hsa-miR-32，9种下调，分别为hsa-miR-1246、hsa-miR-3615、hsa-miR-1、hsa-miR-204、hsa-miR-126、hsa-miR-320d、hsa-miR-320c、hsa-miR-3158、hsa-miR-6510；并筛选出表达差异的新microRNA 2种（表2），均表达下调，分别为hsa-miR-novel-chr2_38600（AUCUGC）、hsa-miR-novel-chr18_21650（GGAAUG）。

表1 高尿酸血症组较对照组差异表达的已知microRNATab.1 The differentially expressed known microRNA in hyperuricemia and control group

表2 高尿酸血症组较对照组差异表达的新microRNATab.2 The differentially expressed new microRNA in hyperuricemia and control group

将表达差异的10种已知microRNA进行聚类分析，绘制分层聚类图，其样品聚类特征树中高尿酸血症组和正常对照组各聚为一类，说明同组样本间的该组microRNA表达相似性较强，重复性良好，而组间各样本该组microRNA表达差异较显著（图1），该组差异表达的microRNA可能参与了高尿酸血症的发生发展，并可能成为诊断高尿酸血症的新型无创生物标志物。

2.3实时荧光定量PCR结果采用实时荧光定量PCR技术检测3个microRNA，其中hsa-miR-1和hsa-miR-205 的2-△△CT与 Fold chage相比总体上调、下调趋势一致且差异倍数相近，但hsa-miR-32的实时荧光定量PCR结果与高通量测序结果相比上调、下调趋势不符（表3）。因此microRNA高通量测序是一种快速有效筛选差异表达microRNA的方法，其结果可供参考，但仍需实时荧光定量PCR进一步验证。

图1 差异表达已知microRNA聚类分析图Fig.1 Cluster analysis diagram of differentially expressed known microRNA

表3 实时荧光定量PCR检测结果与microRNA高通量测序结果比较Tab.3 Comparison of qPCR and high-throughput sequencing microRNA

3 讨论

microRNA最早是由LEE等［3］在秀丽隐杆线虫中发现的，是一类由内源基因编码的长度约为21-25个核苷酸的非编码单链RNA分子。尿液中的外泌体能选择性的富集其来源细胞的多种蛋白质、mRNA、microRNA等，包含了丰富的生物标志物信息，其microRNA比尿液细胞中的更加稳定。

有研究表明，microRNA可以作为多种疾病的生物学标记检测指标［4］。然而，目前为止国内外尚无针对尿液外泌体源性microRNA与高尿酸血症的相关报道。本研究首次将高通量测序技术应用于高尿酸血症患者尿液外泌体中microRNA的检测，结果发现10种已知microRNA表达差异，其中1种上调，9种下调，另有2种新microRNA均表达下调。

有研究报道，表达上调的miRNA-32在肝癌等恶性肿瘤中表达显著上调，并可通过PTFN/Akt通路以促进肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力［5］；表达下调的miRNA-1能特异性的表达于心肌细胞和骨骼肌细胞，直接参与心脏疾病的发生、发展及病理生理过程，特别是心肌肥大、心肌梗死等，同时还调控了心肌病理状态下心律失常的发生发展。XIAO等研究证实，心肌细胞在缺血-再灌注情况下miRNA-204表达下降，而LC3-II表达升高，miRNA-204可能通过调控LC3-II来调节心肌细胞的自溶作用。ROEL等［6］研究认为过表达的miRNA-126与SDF-1/CXCR4依赖的血管内皮祖细胞的动员有关，可通过促进血管再生、调节血管内皮祖细胞动员而维持血管稳态，促进肾脏缺血再灌注损伤后肾功能的恢复。

虽然本研究发现的差异表达的尿液外泌体源性microRNA暂未证实与高尿酸血症的直接相关性，部分还未有研究，但待今后大样本、多中心的实时荧光定量PCR进一步论证后，通过生物信息学分析可揭示microRNA的功能及潜在的具体调控机制，为高尿酸血症发病机制的研究提供依据，减少实验盲目性。而且高尿酸血症与痛风密不可分，并与心脑血管疾病、慢性肾脏病，以及2型糖尿病、肥胖等多种代谢性疾病密切相关［7-9］，microRNA在各种相关疾病中的研究可能为今后进一步研究高尿酸血症与该疾病的相关性提供新的研究方向和依据。

聚类分析图中差异表达的microRNA组在高尿酸血症组和正常对照组中组间差异显著，其差异表达的microRNA组有望成为诊断高尿酸血症的新型无创生物标志物，并可作为今后治疗与监测的靶点。另外，本次测序发现了较多表达差异的新microRNA，亦待今后更深入的研究。