稳定性冠心病患者外周血单核细胞亚型分布特征及影响因素

刘森 王丹 万进东 侯霁芯 刘家欣 冉飞 李文章 王沛坚

成都医学院第一附属医院心血管内科，衰老与血管稳态四川省高等学校重点实验室（成都 610500）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）仍是当下我国最主要死亡原因之一［1］。未来我国CVD的发病率和患病率仍将稳步升高，特别是冠心病等疾病［2］。因此，CVD防治工作面临巨大的挑战。稳定性冠心病（stable coronary artery disease，SCAD）是冠心病中最常见的类型，动脉粥样斑块形成是其主要病理改变。炎症标志物一直被认为与动脉粥样硬化相关，甚至部分炎症标志物可影响患者预后［3］。CANTOS三期临床研究证实炎症因子IL-1β特异性拮抗剂卡纳单抗可在不影响胆固醇水平前提下，降低高敏C反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）水平而减少心肌梗死病人心血管临床终点事件［4］。单核细胞介导人体固有免疫反应，在炎症反应致动脉粥样硬化中起重要作用［3］。随着技术更新，流式细胞术分析单核细胞异质性受到关注，不同单核细胞亚型可能在动脉粥样硬化疾病中参与不同的炎症反应［5］。随着研究深入，人们发现单核细胞可分为经典型单核细胞（classical monocytes，CMs；CD14++CD16-）、中间型单核细胞（intermediate monocytes，IMs；CD14++CD16+）、非经典型单核细胞（nonclassical monocytes，NCMs；CD14+CD16++）三型［6］。三型单核细胞在介导动脉粥样硬化的炎症反应中发挥不同作用［5］。目前尚无三色流式分析稳定性冠心病患者外周血单核细胞亚型特征及其影响因素的报道。本研究以SCAD及排除冠心病患者为研究对象，观察两种人群外周血单核细胞亚型的分布特征，评估IMs预测SCAD的价值，并探究影响IMs分布的因素，为SCAD早期诊断及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1研究对象观察纳入2018年3月至2018年7月在成都医学院第一附属医院心血管内科住院并行冠状动脉造影（coronary angiography，CAG）患者162例。纳入标准：根据临床表现、实验室检查、心电图及CAG诊断SCAD患者96例（SCAD组），非冠心病患者66例（对照组）；排除标准：排除既往有经皮冠状动脉介入史、心胸外科手术史、重大外伤史，合并贫血、慢性营养不良、心房颤动、先天性心脏病，严重心力衰竭、肝脏、肾脏疾病，恶性肿瘤、血液系统、全身免疫性疾病及使用免疫抑制药者。

1.2一般资料包括年龄、性别、身高、体质量、吸烟史、高血压史、糖尿病史、高脂血症史等，并计算体质指数（body mass index，BMI）。所有患者入院后均空腹采集静脉血，完善血常规、肝功能、肾功能、脂类测定、hs-CRP、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）等指标。

1.3CAG方法与判定标准采用Judkins法行多体位CAG，用造影机的测量系统由2名有经验的介入心脏病学医师进行判读，分析左主干、前降支、回旋支、右冠状动脉及其大分支的狭窄程度。以病变管腔最重处狭窄≥50%记为阳性，诊断冠心病，＜50%记为阴性，诊断非冠心病。

1.4三色流式细胞术分析外周血单核细胞亚型对所有入选患者抽取肘静脉血2 mL，置于二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，混匀后2 h内进行染色及流式上机。实验抗体如下：抗CD14-FITC、抗CD16-PE、抗 CD86-PE-Cy5，均购于美国 eBioscience公司。BD Acurri C6流式细胞仪购于美国BD公司。cell staining buffer购于美国bioLegend公司，红细胞裂解液购于中国博士德公司。

1.4.1样品制备（1）取1.5 mL高压灭菌后的EP管若干，标记全阴管（无抗体）、单阳管（分别加入2 μL 的抗 CD14-FITC、抗 CD16-PE、抗 CD86-PECy5等3种流式荧光抗体之一）、全阳管（分别加入2 μL上述三种抗体）。（2）应用全阴管、单阳管调整各个通道的荧光补偿。（3）将其中一名受试者全血100 μL加入至全阴管、单阳管，应用移液器吹打混勾，避光孵育15 min进行流式细胞仪检测方案的调试。（4）将受试者100 μL全血分别加入相应单阳管、全阳管中，移液器吹打混匀。避光孵育15 min，进行免疫荧光染色。（5）向管内加1 mL红细胞裂解液，涡旋混匀。避光孵育10 min，充分裂解红细胞，离心弃上清，加入1 mL cell staining buffer重复洗涤2～3次，最后定容至100 μL。选择调制好的流式程序进行检测。

1.4.2流式上机（1）数据采集：抗体荧光染料FITC，PE，PE-Cy5的激发光波长均为488nm，发射光波长分别为525 nm，572 nm，675 nm。在流式细胞仪对应的通道分别为 FL1，FL2，FL3。（2）根据FSC vs SSC（即前向散射光forward scatter，FSC和侧向散射光side scatter，SSC）调整流式细胞仪程序电压，建立二维点图，初步显示外周血各群细胞。（3）根据二维点图圈出粒细胞、淋巴细胞及单核细胞设门P1。（4）在P1基础上建立横坐标为CD86-PE-Cy5，纵坐标为SSC的散点图。根据细胞表达CD86荧光强度的不同和细胞内颗粒的复杂程度，圈出外周血单个核细胞设门P3。（5）在P3基础上，以CD14-FITC为横坐标，以CD16-PE为纵坐标作二维点图。将单核细胞进一步分为CD14++CD16-亚型、CD14++CD16+亚型和CD14+CD16++亚型，记录各亚型比例。见图1。

图1 三色流式分析外周血单核细胞亚型Fig.1 A three-color flow cytometric analysis for peripheral blood monocyte subset

1.5 统计学方法应用SPSS 21.0统计学软件进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，Pearson相关性分析；计数资料以率或者百分数表示，组间比较采用X2检验；非正态性分布资料以中位数和四分位数间距M（Q1～Q3）表示，采用Mann-Whitney U检验，Spearman秩相关性分析。对具有差异的因素校准影响因素后进行多因素Logistic回归分析。利用受试者工作特征（ROC）曲线分析单核细胞亚型预测SCAD的价值，并计算最佳界值及阳性预测值，用曲线下面积（AUC）及Z检验来判别预测能力及检验差异。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般临床资料比较见表1。

2.2 多因素Logistic回归分析校正混杂因素后，外周血IMs比例、hs-CRP水平为SCAD独立相关因素。进一步校正年龄、性别、吸烟、肥胖、高血压病史、糖尿病史、高脂血症病史等冠心病高危因素后，IMs与hs-CRP独立相关。见表2。

表1 两组患者一般临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical characteristics between SCAD and control group

表2 SCAD多因素Logistic回归分析Tab.2 Multivariate analysis of clinical indicators and SCAD

2.3 外周血IMs比例与hs-CRP水平相关性分析外周血IMs比例与hs-CRP水平呈显著性正相关。见图2。

2.4 外周血IMs比例预测SCAD的ROC曲线外周血IMs比例ROC曲线 AUC=0.824，95%CI：0.756～ 0.879，P＜ 0.01；敏感度0.625，特异度0.955；IMs对应诊断SCAD临界值：8.68%；阳性预测价值85.7%。见图3。

3 讨论

炎症反应学说是动脉粥样硬化形成主流学说之一。从血管保护屏障内皮细胞损伤开始，机体炎症反应即被激活，通过单核细胞参与的固有免疫反应及淋巴细胞介导的获得性免疫反应释放大量的炎症因子，如促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6，抗炎性因子IL-4、IL-10、IL-13。在长期慢性炎症损伤及修复过程中，动脉粥样斑块逐渐形成［7］。部分炎症标志物可预测心血管疾病发生、评估病变程度、影响预后等。CRP是机体响应IL-6等促炎性因子的表达，由肝细胞合成的炎症蛋白，被认为与动脉粥样硬化的发生相关［8］。SUNG等［9］发现男性C反应蛋白水平显著高于女性，在长达近5年的随访中发现男性CRP水平与CVD及全因死亡率相关，且独立于其它心血管危险因素。CRP水平不仅影响预后，还可判断不稳定性心绞痛患者病情，CRP与冠状动脉病变狭窄程度密切相关［10］。一方面，CRP可上调内皮粘附分子表达诱导单核细胞粘附于受损伤内皮，促进巨噬细胞泡沫化、分泌组织因子加快动脉粥样硬化进程；另一方面，CRP也受到单核细胞分泌炎症因子的调节［11］。本研究结果显示SCAD患者hs-CRP水平显著高于非冠心病患者，进一步行多因素分析提示hs-CRP与SCAD独立相关。但研究样本例数较少，且入选患者就诊时间较集中，不排除假阳性可能。

图3 外周血IMs比例预测SCAD的ROC曲线Fig.3 ROC curve of predicting SCAD for peripheral blood IMs

单核细胞是机体固有免疫的重要组成部分，参与病原微生物的吞噬、抗原呈递、T细胞功能调节等重要过程。单核细胞被证实具有异质性，既往研究大多将单核细胞分为经典与非经典两型，OZAKI等［12］基于这种二分法的研究发现循环中CD14+CD16+单核细胞亚型是稳定性心绞痛患者冠状动脉严重程度的生物学标志之一。随着对单核细胞异质性研究的深入，人们根据单核细胞表面脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）受体（CD14）和IgG Fc段受体γIII（FcyIII）（CD16）的表达水平，将单核细胞分为3个亚型：CMs，IMs，NCMs。不同表型分化的单核细胞存在功能差异及互补，参与不同的炎症反应，在特定情况下也可发生表型转化［13］。IMs比例增加被认为与动脉粥样硬化性心血管疾病相关［14］。IMs比例还被认为可能影响心血管疾病预后。在一项队列研究中，IMs可独立预测住院行CAG患者的心血管事件［15］。本研究证实SCAD患者外周血IMs比例显著高于非冠心病患者，与SCAD独立相关，且还提出了IMs比例预测SCAD的最佳临界值。

IMs与动脉粥样硬化形成的联系被认为可能与促炎性因子表达相关。IMs介导分泌TNF-α和IL-1β等促炎性细胞因子均强于其他两型细胞，且在许多慢性炎症性疾病中IMs比例显著增多［16］。英国学者通过动态观察急性ST段抬高性心肌梗死患者外周血单核细胞亚型变化，发现急性期IMs比例显著升高，且与IL-6的升高一致［17］。KRYCHTIUK等［18］将冠心病患者按照脂蛋白a水平划分高水平组和低水平组，结果显示高水平组IMs比例显著高于低水平组，且促炎性因子IL-6、CRP显著升高，而抗炎性因子IL-10无明显差异。MOKHTAR等［19］采用流式设门策略，将单核细胞分为CD14+CD16-，CD14+CD16+两型，证实CD14+CD16+的比例与稳定性心绞痛患者冠状动脉病变程度及CRP水平呈正相关。日本学者还发现稳定性心绞痛患者IMs较其他两型细胞的TLR-4表达量更高，且与斑块的稳定性相关［20］。本研究证实SCAD患者外周血IMs比例与血浆hs-CRP水平呈正相关。目前大多数研究支持IMs介导促炎性反应，参与动脉粥样硬化的发生发展，至于IMs参与具体炎症反应通路及机制尚无统一结论，也缺乏基础实验及证据等级更高的随机、双盲、多中心、大样本的临床研究证实。

单核细胞亚型概念的提出以及各亚型功能的确定有助于深入探讨疾病发生的本质。IMs比例可能与SCAD相关，可望成为SCAD潜在的防治靶点。通过干预单核细胞表型影响炎性分子表达可能为SCAD的防治提供新的信息。