艾瑞昔布不同用药持续时间对大鼠骨折愈合的影响

齐巍 琚绍静 李娴 刘伟 张瑞杰 王建生 孙柏山

唐山市第二医院（河北唐山 063000）

非甾体抗炎药（nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs）具有解热、镇痛、抗炎、抗血小板聚集、抗风湿等作用［1］。尤其选择性环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂是骨折患者伤后及术后重要镇痛药物。它能选择性的抑制COX-2，抑制花生四烯酸（arachidonic acid，AA）转化为前列腺素（prostaglandin，PG），从而减少炎性反应达到抗炎镇痛的作用［2］。研究表明虽然特异性COX-2抑制剂在炎症反应和疼痛方面起重要作用，但同时会延迟骨折的愈合［3］。国内外研究均表明选择性COX-2抑制剂能抑制前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的合成，从而抑制如骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多种细胞因子的合成，影响血管内皮细胞、骨细胞的形成［4］。因此，本研究首选特异性COX-2抑制剂（艾瑞昔布），在动物实验水平观察探讨其不同用药持续时间对大鼠股骨骨折愈合的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂艾瑞昔布（生产批号：BH2017 0338）购于江苏恒瑞医药股份有限公司；兔抗鼠BMP-2和VEGF多克隆抗体均购于武汉博士德生物有限公司；ELISA检测试剂盒订购于武汉云克隆科技股份有限公司；柜式X线照片机购置于美国Faxitron公司；光学显微镜购置于日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1实验动物与分组本实验选取75只SPF级健康SD大鼠，体质量（350±30）g，12周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）-2016-235。饲养于华北理工大学医学动物实验中心SPF级屏障环境；参考《药理实验方法学》等效剂量折算表［5］，将艾瑞昔布溶于0.9%Nacl中配制成混悬液灌胃，实验随机分为正常组：生理盐水灌胃4周；短期用药组：艾瑞昔布混悬液2 mg/（kg·d），灌胃2周后改用生理盐水2周；长期用药组：艾瑞昔布混悬液2 mg/（kg·d），灌胃4周，大鼠股骨骨折模型构建成功后定时给药，8 h/次，持续4周。

1.2.2构建动物模型10%水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉，捆绑固定大鼠，常规备皮、消毒、铺巾，沿右侧股骨长轴行长约1～1.5 cm纵行切口，依次切开皮下组织，钝性分离股骨干，线锯锯断股骨中断，电钻将克氏针顺行插入骨折远端，穿过膝关节，使骨折端达到解剖复位，再将针逆行插入骨折近端，克氏针固定可靠，确保骨折端对位对线良好，缝合各层组织，常规青霉素80万U肌肉注射，2次/d，连续3 d。

1.2.3组织标本制作摄片后10%水合氯醛麻醉，采取急性大失血法处死大鼠，打开胸腔，左心室采血5～10 mL，3 000 r/min，离心15 min，收取上层血清0.5～1 mL，-20℃保存备用。剥离取出右股骨，依次分离软组织，拔出髓内克氏针，保护骨痂组织，截取骨折端长约1～2 cm股骨痂，0.9%Nacl冲洗后于10%甲醛溶液固定，10%硝酸脱钙6周，每周更换脱钙液，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，沿骨痂长轴方向以5 μm连续切片，切片60℃烤箱4 h，取出室温保存备用。

1.2.4放射性（X线）检查术后4周各组各选取5只大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后，进行X线摄片，观察大鼠骨折端骨痂生长和骨折线模糊情况，参考LANE等［6］的X线评分系统进行评估。

1.2.5骨痂骨密度（BMD）测量术后4周各组选取5只大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后，截取右侧股骨，剔除分离软组织，拔除髓内克氏针，保护骨痂组织，以LUNAR双能X线吸收仪扫描，以骨折端2.0 mm×2.0 mm为中心区域，测量骨痂骨密度。

1.2.6血清BMP-2和VEGF浓度测定采用ELISA试剂盒检测，取出血清，稀释标准品，标准品120 μL+标准品稀释液120 μL混合均匀；参照操作说明书分别向空白孔、标准品孔及样品孔加入相应液体，盖上封板膜，振荡均匀，37℃恒温温育60 min；配制洗涤液，揭掉封板膜，洗涤液洗涤，分别加入50 μL显色液A、B，轻轻混匀，放入37℃恒温箱内显色10 min；空白孔调零，以450 nm波长测量各组的吸光度值（OD值）。

1.2.7HE染色取出石蜡切片，二甲苯脱蜡，乙醇逐级水化，流水反复冲洗；苏木精染色10 min，流水冲洗，细胞核着色；0.5%～1%盐酸酒精分化10 s，流水冲洗30 min，返蓝；显微镜下观察细胞核是否着色，蒸馏水洗涤洗3～5 s；0.5%伊红染色2～3 min，流水冲洗；脱水、透明、封片，光镜下观察染色并采集图片。

1.2.8免疫组织化学染色法取出切片，脱蜡、水化、冲洗，胰酶抗原修复30 min，PBS洗涤；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶孵育20 min，PBS洗涤；免疫染色封闭液室温孵育60 min，PBS洗涤；滴加辣根酶标兔抗鼠BMP-2和VEGF抗体，4℃冰箱中孵育过夜，PBS洗涤；羊抗兔二抗，室温孵育40 min，PBS洗涤，DAB显色；苏木素复染2～3 min，流水充分冲洗；1%盐酸酒精分化3～5 s，流水冲洗，脱水、透明、封片，光学显微镜观察并采集图片，Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行半定量分析。

1.3统计学方法SPSS 20.0软件分析，实验数据采用（±s）表示，统计学分析采用单因素方差分析，组间比较采用SNK法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1放射学观察及骨折愈合评分正常组骨折线模糊或消失，骨折端有连续性骨痂包绕，骨痂体积较大，骨痂愈合，骨折处髓腔再通；短期用药组骨折线稍模糊，可见部分骨痂生长，骨折端骨痂连接不紧密；长期用药组骨折线依然清晰可见，未见明显骨痂生长，断端骨痂未连接，骨折愈合欠佳。见图1。经分析，正常组、短期用药组、长期用药组骨折愈合评分分别为：（4.86 ± 0.38）、（3.76± 0.32）、（2.48±0.12），各组之间差异存在统计学意义（P＜0.05），短期用药组和长期用药组较正常组骨折愈合评分显著降低，其中短期用药组和长期用药组之间差异存在统计学意义（P＜0.05），长期用药组较短期用药组骨折愈合评分显著降低。

图1 术后4周X线情况Fig.1 Postoperative 4 weeks X-ray situation

2.2 骨痂BMD测量正常组、短期用药组、长期用药组骨折端骨痂BMD分别为：0.198±0.028、0.156±0.020、0.123±0.014。各组之间差异存在统计学意义（P＜0.05），短期用药组和长期用药组较正常组骨痂BMD显著降低，其中短期用药组和长期用药组之间差异存在统计学意义（P＜0.05），长期用药组较短期用药组骨痂BMD显著降低。

2.3 血清BMP-2和VEGF浓度分别测量正常组、短期用药组、长期用药组血清BMP-2和VEGF浓度（μg/L）分别为：（2.58± 0.52）和（2.77±0.56）、（2.10 ± 0.46）和（2.21 ± 0.50）、（1.42 ± 0.35）和（1.47±0.30）。各组之间差异均存在统计学意义（均P＜0.05），短期用药组和长期用药组较正常组血清BMP-2和VEGF浓度显著降低，短期用药组和长期用药组之间差异存在统计学意义（P＜0.05），长期用药组较短期用药组血清BMP-2和VEGF浓度均显著降低。

2.4 组织学观察正常组骨痂组织为不成熟骨组织伴有成熟骨组织，可见较多成骨细胞，骨小梁生长旺盛，排列致密有序，互相交错网状；短期用药组骨痂组织为大量纤维组织软骨组织，成骨细胞较少，可见大量软骨细胞，骨小梁生长稍稀疏，排列有序，间隙增宽；长期用药组骨痂组织为大量纤维组织，骨小梁生长稀疏，间隙增宽不连续，排列紊乱，大量纤维软骨细胞，成骨细胞少见。见图2。

图2 HE染色观察骨痂的形态结构变化Fig.2 Morphological changes of bone callus was observed by HE staining（× 200）

2.5 BMP-2、VEGF表达BMP-2阳性表达于成骨细胞及其周围和骨小梁的边缘，纤维骨痂中较少，VEGF阳性表达于成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞。依据免疫反应评分得出正常组、短期用药组、长期用药组的BMP-2、VEGF表达分别为：（3.83±0.35）和（2.98±0.25）、（3.14 ± 0.27）和（2.25 ± 0.18）、（2.46 ± 0.22）和（1.50±0.10）。各组之间差异存在统计学意义（均P＜0.05），短期用药组和长期用药组较正常组BMP-2和VEGF阳性表达显著降低，短期用药组和长期用药组之间差异存在统计学意义（均P＜0.05），长期用药组较短期用药组BMP-2和VEGF阳性表达显著降低。见图3、4。

3 讨论

图3 免疫组化观察骨痂组织BPM-2表达Fig.3 The BPM-2 expression in callus was observed by Immunohistochemical（× 200）

图4 免疫组化观察骨痂组织VEGF表达Fig.4 The VEGF expression in callus was observed by Immunohistochemical（× 200）

创伤性骨折后由诸多生长因子、细胞因子、PG等众多因素共同参与细胞生化效应诱发的炎症反应，并且这些因素在新骨形成及整个骨折愈合过程中产生重要作用，骨形成蛋白（bone morphogenic protein，BMPs）属于转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，具有诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化，最终导致软骨、骨形成的作用［7］。BMP-2具有促进成骨细胞分化和诱导间充质细胞分化为成软骨细胞和成骨细胞，导致新骨形成作用，且BMP-2可作用于破骨细胞诱导其骨吸收活性［8］。VEGF作为血管生成的最重要因子，在骨折愈合血管内皮细胞的生成发挥重要作用，能通过作用于其表面受体，促进其增殖和血管生成，为骨折的愈合提供骨再生必需的微环境［9］。同时VEGF也参与骨痂转化、成熟的各个阶段，在血管的形成、软骨的吸收与骨痂的改建的过程中发挥重要作用。研究表明COX-2可诱导VEGF、BFGF，从而促进血管生成，加速骨折愈合率［10］。COX-2/PGE2信号转导通路可通过上调β-catenin表达，进而激活Wnt/β-catenin信号通路上调VEGF表达。此外COX-2/PGE2信号通路还可通过VEGF作用于血管内皮细胞，促进其分裂、增殖，并诱导蛋白水解酶、间质胶原酶等促进微血管形成［11］。研究证实了COX-2高表达可以促进VEGF生成及血管内皮细胞的迁移，COX-2有促进新生血管形成的作用［12］。

TAMOTO等［13］在大鼠骨折模型采用塞来昔布（4 mg/kg·d）和罗非昔布（3 mg/kg·d）进行试验，结果发现治疗后塞来昔布组和罗非昔布组仍能发现骨折线存在。徐晓峰等［14］发现VEGF、BMP-2在骨折愈合过程中发挥重要作用。有研究表明［15］BMP-2和VEGF表达和分布在骨折愈合的不同时期各不相同，并且共同调节骨祖细胞的增殖和成骨细胞、软骨细胞的分化，最终完成骨折修复。同样本研究结果也表明特异性COX-2抑制剂-艾瑞昔布对大鼠骨折愈合有明显抑制作用，尤其长期使用对骨折愈合抑制更加明显，其可能与降低BMP-2、VEGF表达有关。

特异性COX-2抑制剂能够缓解骨折及骨科手术后疼痛，尽管有动物实验数据显示特异性COX-2抑制剂对骨折愈合有不良影响，但是骨折愈合是一个多种因素参与的复杂过程，关于COX-2抑制剂与骨折愈合具体作用机制，还需进一步大量基础实验及临床研究，这些方面的研究将会为我们提供新的思路。使用COX-2抑制剂抑制缓解患者疼痛可以促使患者早期活动、负重，这对骨折愈合又有促进作用，艾瑞昔布是一把双刃剑，有利也有弊，临床医生应该具有足够的警惕意识，仔细衡量利弊，做出正确的临床决策，合理运用，对于骨折患者的镇痛，合理的使用NSAIDs药物，尽量缩短用药持续时间，减少用药剂量，使艾瑞昔布发挥最大功效。