冠状动脉粥样硬化性心脏病侧支循环形成与VEGF-A基因多态性相关性研究

马丽霞，傅广，黄树斌，石顺华，汤华

冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）是由各种因素所致的冠状动脉粥样硬化，引起动脉管腔狭窄或阻塞，出现心肌缺血缺氧性坏死的心脏病，也可由冠状动脉（冠脉）痉挛所致，具有高发病率、高复发率及高死亡率等特点，且其发病逐渐趋于年轻化，已成为21世纪人类面临的“第一健康杀手”[1]。由于其影响因素众多，临床研究难度比较大[2]。近年来，对CAD诊治已取得长足进展，经皮冠脉内血管成形术等介入手术技术成熟，使其治疗疗效得到显著提升。但研究表明，对持续心肌梗死及存在复杂病变患者，即使介入治疗后仍无法完全恢复其正常血运，后期易出现复发，极大影响其预后质量。而有效的侧支循环建立，是促进缺血心肌血供恢复，挽救濒临坏死心肌以及提高预后质量的关键[3]。新血管生成是侧支循环建立的首要关键环节，血管内皮生长因子（VEGF）是体内重要的促血管生成因子，能特异性促进血管内皮生成和修复，在新血管生成过程中起中心调控作用[4]。研究发现，不同患者冠脉侧支循环的建立有差异且受多种因素影响，但遗传因素越来越受到国内外学者的重视，目前，国际上已有相关血管生成相关基因的多态性研究，且得到了肯定的数据[5]。而国内从基因水平探讨冠脉侧支循环建立的研究比较少，尤其基于VEGF-A基因多态性报道甚少，因此本研究就对此课题展开报道，旨在为CAD临床诊治提供指导。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取长沙市第一医院心血管内科于2015年10月～2017年8月间收治的冠心病住院患者200例为研究对象，纳入标准[6]：①均符合2012年中国心脏病协会制定的冠心病诊断标准，且经冠脉造影检查证实；②无合并严重的脑血管、肝肾肺等实质性脏器组织疾病；③均自愿参加本次研究且签署知情同意书。排除标准：①合并先天性心脏病、心肌炎等其他心脏疾病；②合并慢性炎症、结缔组织疾病；③合并肺动脉栓塞、主动脉夹层等动脉疾病；④合并严重创伤或恶性肿瘤。采用rentrop分级法将其分为无侧支循环组和有侧支循环组，分别为113例、87例，两组患者在性别、年龄、吸烟率等一般资料和危险因素比较均无明显差异（P＞0.05），故具可比性。

1.2 方法

1.2.1 冠状动脉造影采用Seldinger法进行股动脉穿刺，同时Judkin法进行选择性左、右冠状动脉造影，选取Ph111ps数字减影X光机对冠脉进行多角度投照，明确冠脉狭窄位置及程度。左冠状动脉和右冠脉分别至少行6个和2个以上体位投影。CAD评价标准：以主要冠脉或是主要分支管腔内径狭窄程度大于50.0%。

1.2.2 侧支循环评定采用选择性冠状动脉造影确诊为冠心病患者，其血管造影录像需再次经2位心内科介入医师采用盲法进行独立复核，包括对其侧支循环来源、走形及闭塞血管远端充盈等情况进行观察。对其侧支循环按Rentrop分级系统进行评级，分为 0级、1级、2级、3级。其中，0级侧支血管缓慢充盈，隐约显像，造影剂充盈和排出时间均明显延长，侧支血管直径＜1 mm，为无侧支循环组；1-3级侧支血管迅速显影，侧支血管显影清楚，造影剂充盈和排出时间接近正常，侧支血管直径＞1 mm，为有侧支循环组。如评价出现分歧，应由3位医师最终进行判断。

1.2.3 血液DNA提取用EDTA抗凝血抽取所有研究对象外周血3 ml，混匀后于冰水中放置0.5 h，2000 rpm离心10 min，去除上清，留管底白细胞，将白细胞打散后，加1 ml 1×细胞核裂解液（STE），打散细胞团、混匀，再加酶解混合液（含350 μl STE、150 μl 10% SDS和10 μl 20 mg/ml蛋白酶K）摇匀，至出现粘稠透明状。37℃温箱过夜或50℃ 3～4 h。加等体积饱和酚（或1/3体积的饱和NaCl），轻摇混匀10 min，室温2000 rpm离心10 min，去除蛋白和SDS的沉淀。小心移上清至另一离心管（尽量避免吸取中间层），加等体积氯仿混匀5 min，室温2000 rpm离心5 min。重复加等体积氯仿混匀5 min，室温2000 rpm离心5 min。将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5 min，再将DNA溶于20～100 L TE中，测OD值[7]。

1.2.4 PCR实验运用TaqMan SNP genotyping assays（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）对血样DNA进行Real-Time PCR设计，并在7500型ABI的PCR仪器上运行，最后数据保存分析。

1.2.5 VEGF-A基因多态性检测采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性法（PCR-RFLP）技术，以外周血提取出的DNA为模板进行PCR扩增，引物序列正向：5，-ACTTCTGGGCTGT TCTCG-3，；反向：5，-TCCTCTTCCTTCTCT TCT TCC-3，。PCR反应体系（50 μl）：基因组DNA约5 μl（400 ng），dTNP 0.4 μl（10 mmol/L），aqDNA聚合酶2U，10×PCR缓冲液约5 μl，正反向引物各0.5 μl（20 μmol/L），剩余由无菌去离子水补充。PCR反应程序：首先95℃预变性5 min，随后95℃30 s、56℃ 45 s、72℃ 1 min，共进行32个循环，再给予72℃延长5 min后，保存于4℃。取5 μl PCR扩增产物、10×酶切缓冲液及3 μl BsmFI限制性内切酶及无菌去离子水进行混合，摇匀后置于38℃水浴锅过夜，将酶切产物经8%聚丙烯酰胺电泳，产物经溴化乙锭染色，在紫外灯下直接读取VEGF-A基因型。引物由北京阅微基因技术有限公司提供，aqDNA聚合酶由上海广锐生物科技有限公司提供，PCR缓冲液由上海铭博生物科技有限公司提供。

1.3 观察指标①比较两组患者的一般资料和危险因素；②比较两组患者的VEGF-A基因rs2010963和rs1570360位点中G等位基因频率，rs699947位点中C等位基因频率，rs3025039和rs833061位点中T等位基因频率，以及各危险的基因型。

1.4 统计学方法数据总结并提出的均值、标准差和描述性统计百分比形式。并不是正常分布的连续数据分析采用Mann-Whitney U检验。分类数据之间的关联进行评估使用 Fisher或卡方检验，Hardy Weinberg检验评估采用卡方检验。使用STATA 11.2 软件进行统计分析。SNPStats软件用于计算连锁不平衡。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组患者的一般资料和危险因素比较两组患者性别、年龄、病程、家族史、吸烟率、空腹血糖、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及空腹血糖（FBG）等一般资料和危险因素比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 两组患者的一般资料和危险因素比较

2.2 两组患者的VEGF-A基因各位点基因型及基因频率比较有侧支循环组的VEGF-A基因rs2010963位点及rs1570360位点的GG基因型比例和G基因频率均高于无侧支循环组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；VEGF-A基因rs699947位点的CC基因型比例和C基因频率均高于无侧支循环组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；rs3025039位点和rs833061位点的TT基因型比例和T基因频率均明显高于无侧支循环组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表2～6）。

3 讨论

CAD是一种临床常见的心血管疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率及多并发症等“四高一多”特点，被认为是21世纪人类健康的“头号杀手”。研究证实[8]，CAD患者冠脉持续狭窄或堵塞，导致局部心肌缺血、缺氧甚至坏死，除可发生心绞痛、心肌梗死外，尚可导致各类心律失常、心脏扩大、心力衰竭及猝死等严重不良心血管事件，严重威胁患者的生命健康。早诊断、早治疗是提高CAD治疗及预后疗效的关键。近年来研究发现，冠脉侧支循环建立对CAD患者预后具有积极影响，而在尸体解剖中发现，CAD患者普遍存在侧支循环现象，且较正常心脏侧支循环建立更为丰富。研究证实，当冠脉狭窄程度到一定范围时，冠脉侧支循环血流会明显增加，以代替正常冠脉血流，起到心脏保护作用，有助于减轻心肌缺血缺氧性坏死程度，降低心绞痛、心肌梗死、心力衰竭等不良心血管事件风险，并能为溶栓及介入治疗提供条件，具有重要的临床意义。但临床研究表明[9]，冠脉侧支循环在不同患者中存在着显著差异，且受多种因素影响，因此明确其影响因素对促进冠脉侧支循环建立有着重要作用。目前研究表明，冠脉狭窄程度是侧支循环建立的独立影响因素，冠脉血管闭塞远端压力降低，当两支冠脉达到足够压力差梯度时，即可促进血流经潜在吻合口形成有意义的侧支循环，是其首要的促动因素。高血压、吸烟史是冠脉狭窄的重要危险因素，有学者指出[10]，其同样为侧支循环建立的促进因素，其中高血压促进机制可分为①高血压可促进左室壁厚度增加，使冠脉吻合口及侧支循环官腔增大；②高血压可提高冠脉与冠脉窦以及冠脉与狭窄血管远端间的压力差，促进冠脉间小动脉开放形成侧支循环，而关于吸烟与侧支循环建立目前尚无确切定论。同时自然状态下血管新生速度较冠脉狭窄速度缓慢，因此“治疗性血管新生”观念也随之出现，即采用药物、转基因等治疗手段，加快缺血心肌内新血管形成，甚至建立有效的侧支循环，最终促进心肌供血供氧恢复，减轻心肌损害。

表2 两组患者的VEGF-A基因rs2010963位点基因型及基因频率比较（n，%）

表3 两组患者的VEGF-A基因rs1570360位点基因型及基因频率比较（n，%）

表4 两组患者的VEGF-A基因rs699947位点基因型及基因频率比较（n，%）

表5 两组患者的VEGF-A基因rs3025039位点基因型及基因频率比较（n，%）

表6 两组患者的VEGF-A基因rs833061位点基因型及基因频率比较（n，%）

目前，在血清学层面对CAD患者侧支循环形成调控的研究，国内已开展诸多，比如血清脂联素水平升高，可改善内皮细胞功能，促进冠脉血管重建，生长分化因子15（GDF-15）、骨桥蛋白可促进冠脉侧支循环形成，基本已得到临床证实。多项研究证实[11]，CAD患者受冠脉狭窄引起心肌缺血、缺氧应激时，可刺激多种细胞因子分泌，对损失后炎性反应和组织修复起着重要作用，其中血管内皮细胞与循环中单核细胞相互作用，导致大量血管生成因子表达，促进新血管生成及侧支循环建立。VEGF是目前公认的重要促血管生长因子，同时也是重要的促血管通透因子，最早于1989年在牛脑垂体滤泡星状细胞中提取出，分子质量约为45 000，由内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞等细胞分泌，在炎症、缺氧、生长因子等因素刺激时分泌可明显增加。研究证实[12]，VEGF可直接作用于内皮细胞特异性有丝分裂原，促进血管内皮细胞分裂、增殖，是正常机体及病理状态下重要的新血管生成调节因子，同时参与缺血、炎症、肿瘤以及多种血管变性疾病发生发展。目前，基于VEGF与CAD发生及治疗转归报道较多，其可通过多种机制参与CAD发生发展，其中VEGF可促进新血管生成以及侧支循环建立，有助于缓解心肌缺血缺氧状态，缩小心肌梗死面积，且VEGF表达越高侧支循环发生率也越高。CAD患者侧支循环建立虽受多种因素影响，但近年来遗传因素关注度逐渐上升，且国外大量数据证实相关血管生成基因多态性与侧支循环建立密切相关，诸如GDF-15基因-3148C/G位点、肝细胞生长因子（HGF）基因C57488A位点与侧支循环均有着密切关系。时强等[13]研究显示，血管紧张素转化酶（ACE）I/D多态性中DD基因型和D基因是可影响CAD患者侧支循环建立。但目前关于VEGF-A基因多态性与CAD侧支循环建立相关性国内尚无大量报道，何皓等[14]研究显示，VEGF+450C/G基因多态性与CAD发生发展密切相关，其中CC基因型和C基因可能是冠心病血管病变的易感基因。本研究笔者在排除血压、吸烟等因素对侧支循环建立影响后，进行VEGF-A基因多态性检测。结果显示，有侧支循环组患者的VEGF-A基因rs2010963位点和rs1570360位点的GG基因型比例和G基因频率均明显高于无侧支循环组（P＜0.05），rs699947位点的CC基因型比例和C基因频率均明显高于无侧支循环组（P＜0.05），rs3025039位点和rs833061位点的TT基因型比例和T基因频率均明显高于无侧支循环组（P＜0.05），提示VEGF-A基因多态性与CAD患者侧支循环建立密切相关，考虑其原因可能与各位点G、C、T等等位基因缺失，导致VEGF-A基因调控区变异，降低启动子和VEGF-A基因转录活性，降低血液中VEGF-A合成，从而影响侧支循环建立[15]。

综上所述，CAD患者的VEGF-A基因多态性与侧支循环形成有关，VEGF-A基因rs2010963和rs1570360位点中G等位基因，rs699947位点中C等位基因，rs3025039和rs833061位点中T等位基因，可能是CAD患者侧支循环形成的促进因素。