表皮生长因子受体及血浆miR相关指标在卵巢癌中的表达及其临床意义

(驻马店市第一人民医院妇产科，河南 驻马店 463000)

卵巢癌是常见的女性恶性肿瘤之一，发病率和致死率占妇科肿瘤的前3位[1-3]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)和miR相关指标在多种恶性肿瘤中均具有较高的诊断价值[4]。本文应用荧光定量PCR法和免疫组化方法测定了EGFR及血浆miR相关指标在卵巢癌中的表达，分析其与卵巢癌临床病理特征的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选取本院2015年10月至2016年10月收治的50例卵巢癌患者，年龄20～73岁，中位年龄48岁；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期患者28例，Ⅲ、Ⅳ期患者22例；浆液性腺癌患者19例，黏液性腺癌患者18例，其他患者13例；低分化20例，中分化19例，高分化11例。同时选取同一时间段到本院就诊的正常卵巢者(子宫肌瘤同时行附件切除的正常卵巢组织)15例。所有患者在手术前均未接受任何放、化疗治疗，并经病理学确诊。

1.2主要试剂与仪器主要试剂：Trizol(美国Invitrogen公司)，dNTP Mixture、Oligo(dT)18、Quantitative Real-time PCR检测试剂盒(日本TaKaRa公司)，RNase Inhibitor、逆转录酶M-MuLV、RNaseA(美国Promega公司)、EGFR鼠抗人单克隆抗体(深圳欣博盛生物科技有限公司)。

主要仪器：Prism®7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，METTER AE260型电子天平(德国Deltalange公司)，TGL-16型高速台式离心机(上海医疗器械六厂)。

1.3方法

1.3.1 荧光定量PCR法测定EGFR、血浆miR相关指标(miR-205、miR-20a及miR-29c)的mRNA水平 收集50例卵巢癌患者、15例正常卵巢者手术切除的标本，并抽取上述研究对象空腹时的外周静脉血，分别采用Trizol试剂提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度，Oligo(dT)18为引物，在M-MLV反转录酶作用下进行cDNA的合成。在GenBank中检索得到人源β-actin(内参基因)、EGFR、miR-205、miR-20a及miR-29c基因序列，利用Premier 5.0引物设计软件设计出PCR检测引物，以上述cDNA为模板，采取荧光定量PCR法测定EGFR、miR-205、miR-20a及miR-29c的mRNA水平。

1.3.2 免疫组化方法测定EGFR蛋白在卵巢癌组织中的表达 所有组织标本均经福尔马林固定、石蜡包埋后制作为4 μm的连续切片，严格按照试剂说明书进行HE染色和免疫组化S-P法染色，并设置阴性对照(以PBS代替一抗)和阳性对照(已知阳性切片)。结果判断：细胞质或细胞膜上出现的棕黄色颗粒即为EGFR蛋白；根据染色细胞所占比例：0分代表无阳性细胞，1分代表阳性细胞占1%～10%，2分代表阳性细胞占11%～50%，3分代表阳性细胞占51%～75%，3分代表阳性细胞占>76%。根据染色强度评分：0分代表无染色，1分代表淡黄色，2分代表淡黄色，3分代表棕褐色。然后计算2个评分之和，0～1分为(-)，2～3分为(+)，4～5分为(++)，6～7分为(+++)，将(-)与(+)定为阴性，(++)与(+++)定为阳性。

2 结果

2.1EGFR及血浆miR相关指标的mRNA在卵巢癌及正常卵巢患者中的表达EGFR mRNA、miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA(0.83±0.12，0.71±0.08，3.64±0.23，0.68±0.05)在卵巢癌患者中的相对表达量均明显高于正常卵巢者(0.38±0.06，0.24±0.07，1.17±0.11，0.18±0.03)，差异均有统计学意义(t=13.954,P<0.001；t=20.497,P<0.001；t=40.705,P<0.001；t=36.676,P<0.001)。

2.2EGFR蛋白在卵巢癌及正常卵巢组织中的表达EGFR蛋白在卵巢癌组织中的阳性率(60.00%)明显高于正常卵巢组织(13.33%)，差异有统计学意义(χ2=7.386，P=0.007)。见表1。

表1 EGFR蛋白在卵巢癌及正常卵巢组织中的表达

2.3EGFR在卵巢癌患者中的表达与临床病理特征之间的关系Ⅰ、Ⅱ期以及中、高分化卵巢癌患者的EGFR mRNA相对表达量(0.66±0.14，0.74±0.14)明显低于Ⅲ、Ⅳ期以及低分化患者(0.85±0.16，0.88±0.15)，差异均有统计学意义(t=4.473,P<0.001；t=3.367,P=0.001)。Ⅰ、Ⅱ期及中、高分化的EGFR蛋白阳性比例(35.71%，46.67%)明显低于Ⅲ、Ⅳ期及低分化(90.91%，80.00%)，差异均有统计学意义(χ2=15.639，P<0.001；χ2=5.556，P=0.018)。见表2。

表2 EGFR在卵巢癌患者中的表达与临床病理特征之间的关系

2.4血浆miR相关指标在卵巢癌患者中的表达与临床病理特征之间的关系Ⅰ、Ⅱ期以及中、高分化卵巢癌患者的miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA相对表达量(0.33±0.04、1.25±0.14、0.27±0.03以及0.37±0.04、1.26±0.11、0.26±0.03)明显低于Ⅲ、Ⅳ期以及低分化(0.63±0.05、4.04±0.20、0.61±0.04以及0.65±0.06、4.17±0.21、0.63±0.04)，差异均有统计学意义(t=23.583、P<0.001，t=55.598、P<0.001，t=33.201、P<0.001；t=18.330、P<0.001，t=56.979、P<0.001，t=35.278、P<0.001)。见表3。

表3 血浆miR相关指标在卵巢癌患者中的表达与临床病理特征之间的关系

3 讨论

EGFR作为一类酪氨酸激酶受体，能够进行细胞信号传递[5-6]。已有研究[7-8]证实，EGFR过度表达引起细胞持续增殖，促进细胞发生恶性转化，与卵巢癌密切相关。在恶性肿瘤患者中，通过人为干预使EGFR降低后，可以明显改善患者的病情。miR指标是目前临床上针对各类肿瘤患者中研究比较热门的指标之一，尤其是miR-205、miR-20a及miR-29c，这些指标同时具有原癌与抑癌双重作用，在卵巢癌中的相关研究资料较为少见[9]。

本研究应用荧光定量PCR法和免疫组化方法测定了卵巢癌患者中EGFR的mRNA和蛋白表达以及血浆miR相关指标(miR-205、miR-20a及miR-29c)的mRNA水平。结果显示，EGFR mRNA及蛋白、miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA在卵巢癌患者中的相对表达量均明显高于正常卵巢者。而且临床分期越晚，组织分化程度越低，其EGFR mRNA、miR-205 mRNA、miR-20a mRNA及miR-29c mRNA的相对表达量越高，EGFR蛋白的阳性率也越高。这提示EGFR与血浆miR相关指标表达越强，卵巢癌恶性程度越高，充分说明EGFR与血浆miR相关指标与卵巢癌的临床分期与分化程度密切相关。因此EGFR与血浆miR相关指标均能作为判断卵巢癌的指标，联合检测EGFR与血浆miR相关指标有助于卵巢癌的早期诊断，及早进行针对性治疗。

综上所述，EGFR与血浆miR相关指标均与卵巢癌的发生均有密切的关系，对于卵巢癌的临床分期与分化程度具有较高的检测意义。