固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中4种新型杀菌剂

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(1.温州出入境检验检疫局,浙江温州 325027；2.绍兴出入境检验检疫局综合技术服务中心,浙江绍兴 312000)

葡萄酒是以新鲜葡萄果实为原料酿造的一种果酒。然而，在葡萄种植过程中为了提高产量，需要使用杀菌剂、杀虫剂和除草剂等农药控制病虫草害，而残留在葡萄中的农药会随着发酵过程迁移至葡萄酒中，因而葡萄酒中经常残留多种农药。杀菌剂是用于防治各种病原微生物引起的植物病害的一类低毒农药，常用于防治葡萄霜霉病、白粉病、黑痘病等病虫害。随着我国人民生活水平的日益提高，葡萄酒进口量持续攀升。据相关数据表明，在2017年的前10个月中，中国总共进口了6.013亿升葡萄酒，进口总额达到22.1亿美元，同比分别上涨了18.92%和15.16%[1]。目前，我国还未针对葡萄酒设定农药残留限量，我国国家标准(GB2763-2016)《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》仅对原料葡萄设定了农药残留限量标准[2]。为了提高进口及内销葡萄酒的质量安全，建立葡萄酒中农药残留分析方法对于监管机构提供技术支持、保障国人食品安全具有重要意义。

近年来，关于葡萄酒中农药残留的检测方法主要集中在气相色谱-质谱法[3 - 7]和液相色谱-串联质谱法[8 - 14]，前处理主要采用QuEChERS[3 - 5,13 - 14]、固相萃取[7 - 12]、固相微萃取[6,15]等。硅噻菌胺、氟吡菌胺、吲哚磺菌胺和啶酰菌胺是近年来德国、美国、日本等国农药公司开发的新型杀菌剂，目前国内外研究报道较少，尚未见同时测定葡萄酒中该4种杀菌剂的检测方法。葡萄酒样品基质复杂，为对其中含有的痕量杀菌剂进行准确定性和定量，本研究采用聚合物填料的固相萃取小柱一步完成提取和净化，采用高选择性和灵敏度的气相色谱-串联质谱法进行分析，方法快速简便，抗干扰能力强，适合批量葡萄酒样品的检测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Trace1300/TSQ8000气相色谱-三重四极杆质谱仪(美国，赛默飞公司)；24管固相萃取仪(美国，赛默飞公司)；Milli-Q超纯水器(美国，Millipore公司)。HR-X固相萃取柱(德国MN公司，60mg/3mL)。

硅噻菌胺(纯度98.0%，CASNo.175217-20-6)、氟吡菌胺(纯度99.0%，CASNo.239110-15-7)、吲哚磺菌胺(纯度99.0%，CASNo.348635-87-0)、啶酰菌胺(纯度99.0%，CASNo.188425-85-6)，均购自德国Dr.EhrenstorferGmbH公司。甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯(美国TEDIA公司)；其他试剂未说明均为分析纯。

葡萄酒样品来自客户委托检测样品。

1.2 样品前处理

取1g酒样，加入1mL水，混匀，加入到已预先活化好(依次用3mL甲醇、3mL水活化)的HR-X小柱上，自然重力过柱后真空抽干3min，先用0.5mL乙酸乙酯洗脱，弃去流出液，再加乙酸乙酯洗脱，于刻度离心管中收集洗脱液1mL，直接供GC-MS/MS测定。

1.3 基质匹配标准溶液的配制

分别称取各杀菌剂标准品25mg，用甲醇溶解并转移至25mL容量瓶中定容，配制成1000mg·L-1标准储备液。取适量储备液用乙酸乙酯稀释配制成1000ng·mL-1和100ng·mL-1混合标准工作溶液。基质校准工作溶液制备：选取葡萄酒样品，按照1.2节方法进行样品处理并供GC-MS/MS测定，确认不含4种目标物后，再取该葡萄酒7份进行样品处理以获取空白基质液，分别取1000ng·mL-1的混合标准工作溶液100、50、20μL，各加入900、950、980μL空白基质液，得100、50、20ng·mL-1的基质匹配混合标准溶液，分别取100ng·mL-1的混合标准工作溶液100、50、20μL，各加入900、950、980μL空白基质液，得10、5、2ng·mL-1的基质匹配混合标准溶液。

1.4 色谱-质谱条件

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

取5mg·L-1的混合标准溶液，采用AUTOSRM模式进行质谱条件自动优化，首先在全扫描模式下选取母离子，在确定母离子后，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析，进一步优化碰撞能量等质谱参数的优化，使各分析化合物的响应最大化。质谱参数及母离子和子离子详见表1，各物质定量离子对的MRM图见图1。

图1 4种杀菌剂标准溶液(5.0ng·mL-1)的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of standard solution of four fungicides(5.0 ng·mL-1)

CompoundtR(min)Parent ion(m/z) Daughter ion(m/z)CE(eV)CompoundtR(min)Parent ion(m/z) Daughter ion(m/z)CE(eV)Silthiofam8.27252.1197*12Amisulbrom13.27225.9119.9*30252.121012225.9146.928Fluopicolide11.06347171.9*18Boscalid13.57342.111238347176.126342.1140*12

*quantification ion.

2.2 固相萃取小柱的选择和优化

分别试验了HR-X小柱(60 mg/3mL，德国BESTOWN公司)、C18小柱(1 000 mg/6mL，德国BESTOWN公司)、HLB小柱(500 mg/6mL，上海安谱公司)，发现HLB小柱对目标物的吸附较强，用乙酸乙酯不易洗脱，用甲醇虽然能洗脱下来，但是葡萄酒中本已吸附在小柱上的色素也同时被洗脱下来，净化效果差；比较HR-X小柱和C18小柱，回收率均较好，但是后者需要3 mL乙酸乙酯才能洗脱目标物，洗脱液还需氮吹浓缩后才能供GC-MS/MS测定，而前者只要1 mL乙酸乙酯就能洗脱目标物，且洗脱液能直接供GC-MS/MS测定。故本实验最终选择HR-X小柱(60 mg/3mL)做前处理吸附和净化。

2.3 方法的线性范围与相关系数

实验采用基质匹配标准曲线消除基质效应，空白样品按照1.2节前处理，配制一系列基质匹配标准溶液，在选定的色谱和质谱条件下进行测定。结果表明，4种杀菌剂在2.0～100.0 ng·mL-1范围内具有良好的线性，得到的线性方程、相关系数见表2。在实际样品加标2.0 μg·kg-1中，各物质的信噪比(S/N)：硅噻菌胺24.6；氟吡菌胺89.9；吲哚磺菌胺17.6；啶酰菌胺37.4，均大于10，满足定量要求，故本方法将4种杀菌剂的定量限定为2.0 μg·kg-1。

表2 4种杀菌剂的线性方程、相关系数和定量限

2.4 加标回收率

取空白葡萄酒样品进行浓度分别为2.0、5.0、20.0 μg·kg-1的4种杀菌剂加标回收率实验，按照本方法进行测定，方法平均回收率为77.2%～93.9%，相对标准偏差不大于7.8%。回收率与相对标准偏差(RSD)列于表3。由表3可知该方法显示了较好的回收率与精密度。

表3 葡萄酒中4种杀菌剂加标回收率及相对标准偏差(RSDs)(n=6)

2.5 实际样品测定

对客户委托的100批次葡萄酒样品按本方法进行了测定，均未检出4种杀菌剂。

3 结论

本文建立了固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中硅噻菌胺、氟吡菌胺、吲哚磺菌胺和啶酰菌胺的分析方法。该方法简便、准确、灵敏，可用于葡萄酒中4种杀菌剂的测定。