基于分子印迹聚合物吸附剂应用于西红柿中对硫磷农药残留的检测

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(江西省科学院应用化学研究所，江西南昌 360102)

对硫磷是一种广谱性杀虫、杀螨剂，对害虫具有强烈的触杀和胃毒作用，为胆碱酯酶抑制剂[1]。对硫磷可残留在大米、鸡肉、猪肉、牛肉、大蒜、洋葱、苹果等食物中，其限量指标一般为0.1mg/kg。目前，有机磷农药残留的分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱法(GC)，以及与质谱联用(LC-MS和GC-MS)等[1 - 3]。样品的前处理方法对于农药残留分析来说十分关键。常用的前处理方法有液-液萃取和固相萃取[4 - 5]，但多数固相萃取吸附剂都有选择性差的缺点。分子印迹聚合物(MIPs)对目标分子具有特异选择性吸附[6 - 8]，已用于水果和蔬菜中农药残留分析[9 - 12]。但大多数MIPs的制备采用传统有机聚合方法，存在识别位点不均一，传质阻力大，选择性差，动力学平衡慢的缺点。本文选择球形硅胶为载体，采取不同于有机自由基聚合方式，通过溶胶-凝胶方法制备对硫磷分子印迹聚合物，并以其作为吸附材料，结合高效液相色谱法，成功地用于西红柿样品中对硫磷的选择性富集和检测。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

L-550台式低速离心机(长沙市湘仪离心机有限公司)；UV-2450型紫外-可见分光光度计、SS-550扫描电子显微镜(日本，岛津公司)；VARIO-EL元素分析仪(德国，Elementar公司)；AVATAR360傅立叶红外光谱(美国，Nicolet公司)；LC-20AT高效液相色谱(日本，岛津公司)。

有机磷农药对硫磷(PT)、对氧磷(PO)、三唑磷(TPO)和喹硫磷(QP)标准品，均购于德国Dr.EhrenstorferGmbH公司；四乙氧基硅烷(TEOS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、苯基三甲氧基硅烷(PTMOS)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，均购于AlfaAesar化学试剂公司；甲醇、乙腈、无水乙醇和乙酸，均购于天津市康科德科技有限公司；其他试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

1.2 对硫磷分子印迹聚合物的制备

采用溶胶-凝胶法制备对硫磷分子印迹聚合物。具体过程如下：称取200mg粒径大约为50μm球形硅胶，分散在10mL无水乙醇中，然后加入交联剂TEOS3mL，功能单体APTES和PTMOS各200μL，室温振荡30min后，加入0.1mol·L-1的对硫磷乙醇溶液800μL，二次蒸馏水1mL，浓HCl100μL，室温下反应24h。产物先用无水乙醇洗涤三次，干燥。然后用甲醇-乙酸(9∶1,V/V)洗脱聚合物中的模板分子，直至洗涤液在275nm处无紫外吸收。用甲醇洗涤印迹聚合物三次以除去残留的乙酸，最后在60℃条件下真空干燥至恒重，即得到对硫磷分子印迹聚合物(MIPs)。非印迹聚合物(NIPs)的制备除不加入模板分子对硫磷外，其它步骤相同。

1.3 对硫磷分子印迹聚合物应用于西红柿样品中对硫磷的检测

西红柿样品的制备参考文献方法[13 - 14]并稍作改进：称取西红柿样品100g，洗净并搅拌成汁，再用100mL乙腈萃取，搅拌5h，静置抽滤后用50mL正己烷萃取。萃取液中加入50mL磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.6)。分别移取溶液10mL，三份，加入2、5、10μL100mg·L-1对硫磷标准溶液。分别用20mL乙醇、20mL水活化对硫磷MIPs和NIPs固相萃取小柱，抽干后上样，向柱子中加入不同批次、不同添加水平的西红柿样品，上样体积为1mL，共计10次，使样品缓慢通过分子印迹固相萃取小柱后，用3mL丙酮淋洗，再用3mL乙醇洗提，得到洗提液。将洗提液氮吹干后，用1mL色谱流动相重新定容，再用高效液相色谱测定对硫磷的浓度。每个添加水平平行测3次。

1.4 高效液相色谱条件

色谱柱：VP-ODSC18柱(150×4.6mm,5μm;日本岛津);流动相：乙腈-水(70∶30,V/V);流速1.0mL/min;进样体积100μL;检测波长278nm。

2 结果与讨论

2.1 对硫磷分子印迹聚合物的表征

图1为硅球、对硫磷分子MIPs和NIPs的扫描电镜(SEM)图。由图可见，与裸硅球相比MIPs和NIPs包覆的硅球，表面粗糙度增加，但是形成的膜层较薄，使粒径几乎没有变化，形状仍为球形，大小约为50μm。分别取一定量硅球和MIPs包覆的硅球，采用KBr压片法，扫描他们的红外光谱(图略)，结果显示在1100cm-1处有Si-O伸缩振动特征吸收峰；相比于裸硅球，MIPs包覆的硅球在1470cm-1和1580cm-1处有NH2的特征吸收峰出现，说明硅球表面已包覆上APTES，但是图中苯基1400cm-1～1600cm-1的峰可能与NH2的特征吸收峰重叠。进一步对硅胶和MIPs包覆的硅球进行元素分析，相比于硅球，发现MIPs包覆的硅球中C元素的百分含量由0.26%增加到2.49%，N元素的含量从0%增加到0.32%，证明功能单体APTES与PTMOS已经接枝到球形硅胶上。

图1 硅球(a)，对硫磷分子印迹聚合物(b)和非印迹聚合物(c)包覆的硅球扫描电镜图Fig.1 SEM images of silica spheres(a),MIPs-parathion(b),NIPs-parathion(c)-coated silica spheres

2.2 对硫磷分子印迹聚合物吸附性能研究

对硫磷分子印迹聚合物吸附性能用饱和吸附容量(Q)，吸附选择性用印迹因子(α)评价。依据公式计算Q:Q=(c0-ct)·V/m。 式中，c0和ct(mg·L-1)分别是试液的初始浓度和吸附后剩余浓度；V(mL)是试液的体积；m(mg)是吸附剂的质量。α定义为MIPs和NIPs饱和吸附Q量之比值(QMIPs/QNIPs)。

2.2.1吸附介质的筛选和优化称取10 mg对硫磷MIPs和NIPs，各3份，置于离心管中，加入10 mg·mL-1的对硫磷标准溶液4 mL，吸附介质分别为PBS及含10%乙腈、含10%丙酮的PBS。室温下振荡5 min后，取上清液，经0.45 μm滤膜后，用HPLC法测定对硫磷浓度。如图2所示，以PBS为吸附介质时，MIPs的Q为3.32 mg·g-1，α为1.44；而含10%乙腈的PBS为吸附介质时，MIPs的Q降为1.09 mg·g-1，α为1.48；改用含10%丙酮的PBS时，MIPs的Q为1.27 mg·g-1，而α有较大增加，达到2.11。α提高说明印迹聚合物对模板分子的非特异性吸附降低了。我们进一步考察了PBS中丙酮含量的影响，结果显示随着PBS中丙酮含量的不断增加，MIPs对模板分子的Q不断降低，但α不断增加，当PBS中丙酮含量超过10%后，α便开始下降(图3)。推测原因是随着有机相的加入，能够降低载体的物理吸附。因此，选择含10%丙酮的PBS作为吸附介质。

图2 溶剂对分子印迹聚合物与非印迹聚合物吸附容量Q和印迹因子α的影响Fig.2 The effect of solvent on the Q and α of MIPs and NIPs

图3 磷酸缓冲液中丙酮含量对分子印迹聚合物与非印迹聚合物吸附容量Q和印迹因子α的影响Fig.3 The effect of acetone content in the PBS on the Q and α of MIPs and NIPs

2.2.2分子印迹聚合物对对硫磷吸附性能的研究MIPs与NIPs对模板分子对硫磷的动力学吸附如图4a所示。在前3 min，MIPs和NIPs吸附对硫磷的量增加较快，到4 min时就能达到吸附平衡。MIPs与NIPs的等温吸附结果如图4b所示。一定温度下，随着对硫磷浓度的增加，吸附容量迅速增加，当对硫磷的浓度达到25 mg·mL-1时吸附曲线变得相对平缓。对于同一浓度的对硫磷溶液，MIPs的吸附容量明显高于NIPs，两者饱和吸附量分别为1.33 mg·g-1和0.63 mg·g-1。MIPs的吸附容量是NIPs的2.12倍。造成这种吸附容量差异的原因是模板分子结构中的硝基具有强拉电子作用，功能单体APTES分子中含有带孤电子对的氨基，氨基为对硫磷缺电子的硝基提供电子从而形成氢键；另一方面，PTMOS分子中的苯环可与对硫磷分子的苯环形成π -π共轭作用，因此该MIPs对模板产生了吸附作用，而NIPs由于没有模板分子的印迹位点，其对模板的吸附属于非特异性吸附。

图4 (A)对硫磷分子在MIPs和NIPs上的动力学吸附曲线；(B)MIPs和NIPs对不同浓度的对硫磷的等温吸附曲线Fig.4 (A)Curves of adsorption kinetics of MIPs and NIPs towards parathion;(B) Adsorption isotherm of parathion towards MIPs and NIPs

2.3 对硫磷分子印迹固相萃取柱洗脱条件的优化

在3 mL的空白固相萃取小柱中放入一片10 μm的筛板，称取MIPs 100 mg，向其中加入3 mL甲醇，搅匀后倒入空白固相萃取小柱中，抽干后，再放一片10 μm的筛板，将聚合物压紧压实，得到对硫磷分子印迹聚合物固相萃取(MISPE)小柱。NISPE小柱的制法与其相同，只是填料为NIPs。MISPE的吸附能力与制备的反应溶剂和固相萃取中使用的溶剂类型有关。为了优化MISPE的洗脱条件，先选择3 mL 二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、乙酸乙酯和水分别作为淋洗溶剂，收集洗脱液用HPLC法测定，结果如图5所示。从图5可以看出，丙酮作为淋洗溶剂，MISPE柱对模板分子的保留能力最强，模板分子在MIPs和NIPs上的淋洗回收率分别为10.8%和57.4%。乙醇为洗脱溶剂时，吸附在印迹柱和非印迹柱上的模板分子的保留都是最弱的，印迹柱和非印迹柱上的模板分子的洗脱回收率分别为83.5%和108%，乙醇几乎可以将非印迹柱上的模板分子完全洗脱下来，这样可以弥补丙酮对非印迹柱洗脱能力的不足。另外，乙酸乙酯、乙腈和甲醇的淋洗和洗脱性能相似。模板分子在印迹柱和非印迹柱上的保留体现了印迹聚合物对模板分子的选择性吸附，因此最终选择丙酮作为淋洗溶剂，乙醇作为洗脱溶剂。

2.4 对硫磷分子印迹固相萃取柱对模板分子及其相似物的选择性吸附

进一步考察分子印迹固相萃取小柱对模板分子的选择性，研究了MISPE柱和NISPE柱对模板对硫磷及其结构相似物对氧磷、三唑磷和喹硫磷的吸附。从图6中可以看出，MISPE柱对对硫磷具有较好的选择性吸附，印迹因子α大于2.0；而MISPE柱和NISPE柱对农药对氧磷、三唑磷和喹硫磷的吸附能力相近，说明MISPE柱对上述3种有机小分子没有特异性识别性能。

图5 8种溶剂对模板分子在分子印迹固相萃取柱与非印迹固相萃取柱上的淋脱回收率Fig.5 The elution of eight solvents towards template in the MISPE and NISPE columns

图6 分子印迹固相萃取柱和非印迹固相萃取柱对模板分子及其相似物的吸附Fig.6 The adsorption of template and structure analogues in the MISPE and NISPE columns

图7 西红柿空白样品(A)和添加10 μg·kg-1对硫磷标准溶液(B)直接分析以及经过固相萃取后用HPLC分析的色谱图Fig.7 Chromatograms of tomato samples with blank(A) and spiked parathion of 10 μg·kg-1(B) through direct analysis and after enrichment of SPE

2.5 对硫磷分子印迹固相萃取柱对西红柿中对硫磷的富集研究

将MISPE柱应用于西红柿样品中对硫磷的富集，收集洗脱液，定容后用HPLC法测定。MISPE结合HPLC方法的线性范围为0.10～20.0 mg·L-1，检测限(3σ)为0.097 mg·L-1，定量限为0.32 mg·L-1(10倍信噪比)。

为了验证MISPE结合HPLC法测定有机磷农药残留的可靠性，在西红柿样品中添加不同浓度的对硫磷标准溶液，测定其回收率，在10.0、25.0和50.0 μg·kg-1添加水平下，所添加的三个浓度分别为国家标准的1/10、1/4和1/2，用MISPE柱富集样品中对硫磷，其回收率分别为41.5±4.8%、55.8±7.2%和76.1±4.9%，相对标准偏差(RSD)小于7.2%。萃取回收率低于文献报道的以久效磷为模板的分子印迹聚合物萃取水、土壤中有机磷农药的回收率[9]。将MISPE用于复杂样品中痕量对硫磷的富集和检测(图7)，在10 μg·kg-1的添加水平上，直接HPLC法分析，对硫磷色谱峰未出现，经过MISPE柱的富集分离之后，对硫磷能够被HPLC法检测，而空白样品中则没有对硫磷农药残留。

3 结论

本文以球形硅胶为载体，对硫磷为模板分子，氨丙基三乙氧基硅烷和苯基三甲氧基硅烷为双功能单体，四乙氧基硅烷为交联剂，无水乙醇为溶剂，用溶胶-凝胶法制备了对硫磷分子印迹聚合物。结果表明,对硫磷分子印迹聚合物对模板分子具有高的吸附容量，动力学响应快，选择识别性能良好。以制备的分子印迹聚合物为吸附剂装填固相萃取小柱，结合HPLC法用于西红柿中对硫磷残留的分析检测，方法回收率可达76.1%，有望应用于农产品中有机磷农药残留量的分析检测。