可逆加成-断裂链转移沉淀法制备对羟基苯甲酸丁酯分子印迹聚合物及其应用

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(1.齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.黑龙江肇东市第二中学，黑龙江绥化 151100)

对羟基苯甲酸酯类化合物(Parabens)亦称尼泊金酯[1]，通常包括对羟基苯甲酸甲酯(MP)、对羟基苯甲酸乙酯(EP)、对羟基苯甲酸丙酯(PP)和对羟基苯甲酸丁酯(BP)。该类化合物由于其化学稳定性好、抗菌活性强、pH应用范围广等优点，在食品、化妆品及医药等行业用作防腐剂。但对羟基苯甲酸酯类化合物具有弱雌激素活性作用[2]，长期使用危害人体健康。中国化妆品卫生规范(2007版)[3]中规定：单一对羟基苯甲酸酯的质量分数不应超过0.4%，混合酯的总量不可超过0.8%。因此，对化妆品中对羟基苯甲酸酯类化合物的灵敏、准确检测尤为重要。

化妆品中成分复杂，其前处理手段[4]如液液萃取、固相萃取和固相微萃取等选择性较低。将分子印迹聚合物(MIPs)与固相萃取相结合，可选择性富集对羟基苯甲酸酯，但目前多数研究仅限于对一种对羟基苯甲酸酯富集[5 - 7]，限制了其在实际样品中的应用。因此，建立一种同时富集与检测化妆品中对羟基苯甲酸酯的方法具有重要意义。本文采用分子印迹技术，以对羟基苯甲酸丁酯为模板分子，采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)自由基聚合[8 - 9]与沉淀聚合相结合，制备了分子量分布窄、粒径均一，并且对对羟基苯甲酸酯类化合物具有组选择性的MIPR微球，将该微球用作固相萃取材料，结合高效液相色谱分析，测定化妆品中对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY高效液相色谱仪(Waters科技有限公司)；TΜ-1901型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；S-4300型扫描电子显微镜(日本，Hitachi公司)。

对羟基苯甲酸酯类化合物(MP、EP、PP、BP)、柠檬酸(CA)、苯甲酸(BA)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；α-甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)，天津市科密欧化学试剂中心；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，东京化成工业株式会社；氯化苄，Sigma试剂有限公司；偶氮二异丁腈(AIBN)，北京化工厂。以上试剂均为分析纯。甲醇、乙腈为色谱纯，天津市科密欧化学试剂中心。实验用水为蒸馏水。

1.2 可逆加成-断裂链转移(RAFT)沉淀聚合法制备分子印迹聚合物

1.2.1RAFT试剂二苄基三硫代酯的制备参考文献方法[10]，采用相转移催化法制备二苄基三硫代酯(DBTTC)。

1.2.2分子印迹聚合物的制备准确称取模板分子BP 0.0971 g(0.5 mmol)与功能单体AM 0.1422 g(2 mmol)加入到20 mL乙腈中，超声30 min使其均匀分散，室温下预组装12 h；加入1.19 g(6 mmoL)交联剂EDMA、0.03 g引发剂AIBN和RAFT链转移试剂(DBTTC)0.1 g，超声溶解后，充氮除氧，置于60 ℃ 水浴锅中聚合24 h，真空抽滤获得聚合物；用甲醇∶乙酸(9∶1，V/V)溶液洗至无BP检出，用甲醇抽滤，洗去过量乙酸，真空干燥，得到分子印迹聚合物(MIPR)。非印迹聚合物(NIPR)除不加模板分子外，步骤同上。按上述步骤不加RAFT试剂，制备传统印迹聚合物(MIPT)与传统非印迹聚合物(NIPT)。

1.3 分子印迹聚合物吸附性评价

1.3.1静态等温吸附实验配制不同浓度梯度BP溶液(0.02～0.2 mg/mL)，分别加入10 mg聚合物，超声30 min后室温静置24 h。取上清液1 mL，0.45 μm膜过滤，高效液相色谱法(HPLC)检测。

1.3.2选择性吸附实验称取5份各20 mg的MIPR与NIPR，分别加入到1.0 mg/mL的MP、EP、PP、CA、BA溶液中，静置24 h，取上清液1 mL，0.45 μm膜过滤后，HPLC法检测。

1.4 实际样品分析

1.4.1固相萃取柱的制备称取50 mg MIPR，装填于3 mL带有滤板的聚丙烯空柱中，制成分子印迹固相萃取(MISPE)小柱。

1.4.2化妆品样品的处理及回收率测定称取5.0 g市售的BB霜样品，加入30 mL乙醇，超声溶解30 min 后，过滤，取3 mL滤液，上样于甲醇活化后的MISPE中，萃取后用5 mL蒸馏水淋洗，10 mL甲醇-乙酸(9∶1，V/V)洗脱，将洗脱液N2吹干，1 mL流动相定容，0.45 μm膜过滤，HPLC法检测。

1.4.3HPLC分析条件色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm，1.7 μm)，流速0.5 mL/min；流动相为乙腈；紫外检测波长254 nm。

2 结果与讨论

2.1 分子印迹聚合物形貌表征

采用扫描电子显微镜(SEM)对MIPT及MIPR的形貌进行表征。如图1所示，传统沉淀法制得的MIPT粒径大小不一，且有粘连，RAFT法制得的MIPR外貌呈均匀球形，粒径(约为4 μm)明显增大，且微球之间没有粘连，更适合用于固相萃取填料。这归功于RAFT试剂在制备微球聚合反应中的调控作用。

图1 聚合物扫描电镜(SEM)图 Fig.1 SEM images of MIPT and MIPR a.MIPT;b.MIPR.

2.2 分子印迹聚合物吸附性评价

2.2.1静态等温吸附采用静态等温吸附实验[12]得到4种聚合物在0.02～0.2 mg/mL线性范围内的吸附等温线。如图2所示，聚合物的吸附容量Q随着BP浓度的增加而增加；当BP的浓度高于0.16 mg/mL时，吸附趋于平衡，表明聚合物上的活性结合位点达到吸附饱和。MIPR和MIPT的吸附容量(41.8 mg/g，33.5 mg/g)大于NIPR和NIPT的吸附容量(13.7 mg/g，15.7 mg/g)，这是由于分子印迹聚合物中含有与BP相匹配的印迹孔穴与相应的结合位点，特异性吸附作用使吸附容量较大，而非分子印迹聚合物对模板分子的吸附没有特异性，吸附容量较小。同时，MIPR的吸附容量高于MIPT，这是由于RAFT试剂的加入使聚合物微球粒径分布均匀，内部孔穴更加均匀所致，结合位点增多，吸附容量较高。相反，NIPR的吸附容量低于NIPT，这是由于RAFT试剂的引入，增大聚合物的粒径，降低聚合物微球的比表面积，所以NIPR吸附容量较NIPT小。

在分子印迹中，常用Scatchard模型[13 - 14]评价MIPs的结合特性，Scatchard曲线如图3所示。图中有两条线性相关的直线，拟合方程和相关系数分别为：y=-26.0x+719.6，R2=0.9993和y=-3.2x+431.4，R2=0.9714。说明在所研究的浓度范围内，MIPR与BP之间存在高、低两种结合位点。结合其结构分析，其作用力一种是酸碱作用，另一种是氢键作用。

图2 MIPR、MIPT、NIPR和NIPT的吸附等温线Fig.2 Adsorption isotherm of MIPR，MIPT，NIPR and NIPT

图3 Scathard分析曲线Fig.3 Scatchard analysis plot

分别用Langmuir、Freundlich吸附等温线模型[15]对吸附平衡数据进行拟合。如果符合Langmuir吸附等温模型，则表示聚合物表面是均匀的，只覆盖一种吸附位点，是单分子层吸附。如果符合Freundlich吸附等温模型，则聚合物对模板分子的吸附是多分子层的，且是非均一的。MIPR对BP的两种吸附等温线模型参数见表1，通过比较R2可以看出，印迹聚合物吸附行为与Freundlich模型更加吻合。这表明印迹聚合物的吸附过程是多层吸附，与Scatchard分析结果一致。

表1 MIPR的吸附等温模型参数

2.2.2选择性吸附分别选取4种尼泊金酯(MP、EP、PP和BP)，以及另外两种化妆品中常用的物质苯甲酸(BA)和柠檬酸(CA)作为对照品，测定MIPR的吸附选择性。MIPR和NIPR的选择性吸附实验结果如图4所示，MIPR对4种尼泊金酯均有较高的吸附容量，对模板BP的吸附容量最高，这是由于MIPR中存在与模板BP相匹配的印迹孔穴及结合位点，对模板表现出较好的特异性和较高的吸附能力；对同属于Parabens的MP、EP、PP也具有较好的吸附容量，这是因为MP、EP、PP与BP不仅结构相似，与聚合物相作用的位点也相同，所以吸附容量也较大；而对不属于Parabens的BA、CA的吸附容量较低(17.1 mg/g、15.0 mg/g)，这是由于BA、CA与BP的分子结构存在明显差异，且没有相应的识别位点，不能进入印迹孔穴，无特异性吸附，只有物理吸附作用。而NIPR对6种物质的吸附容量没有明显差异，是由于聚合物中没有特定的孔穴，对6种物质均只存在物理吸附，吸附容量均较小且无明显差异。

2.3 实际样品分析中的应用

2.3.1方法建立将分子印迹固相萃取(MISPE)与HPLC法相结合建立分析方法，并以回收率和相对标准偏差(RSD)为指标对方法进行评价，MP、EP、PP、BP在0.1～10 μg/mL范围内线性良好，R2=0.9967，对样品中对羟基苯甲酸酯的加标回收率测定结果见表2。对模板分子BP的加标回收率最高为96.0%，这是由于MIPR对BP的高吸附容量，经洗脱液将BP洗脱后，能达到良好的分离富集效果，故回收率最高。对于同属于尼泊金酯类的另三种酯，回收率也较高(81.5%～91.0%)，这是因为MIPR可以结合与模板空间结构相似的MP、EP和PP，所以对另3种酯也有较高的吸附能力。对4种尼泊金酯的检出限为0.0185～0.0334 μg/g，定量限为0.0617～0.111 μg/g。

表2 BB霜样品的测定结果及回收率(n=3)

图5 BB霜样品MISPE前后色谱图Fig.5 Chromatograms of BB cream before and after MISPE

2.3.2实际样品色谱图以MIPR为固相萃取材料，对BB霜样品中的对羟基苯甲酸酯类化合物进行富集纯化，其色谱图见图5。由图可知，MISPE萃取后，有效去除了基质干扰，样中的对羟基苯甲酸酯类化合物得到明显富集，4种酯含量在0.162～0.385 μg/g之间，符合中国化妆品卫生规范[3]。

3 结论

采用RAFT-沉淀聚合法，制备了对羟基苯甲酸丁酯分子印迹聚合物，与传统法相比该聚合物形貌规则，对模板分子的吸附能力更强。经数学模型验证，存在两类结合位点，吸附过程属于多层吸附。选择性吸附实验表明，其对对羟基苯甲酸酯具有良好的组选择性。将其作为固相萃取填料结合UPLC，对BB霜样品中的痕量MP、EP、PP、BP进行富集分析，回收率在81.5%～96.0%之间，RSD%≤5.6%。方法检出限和定量限均低于国家标准。